Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Dit onderzoek werd financieel ondersteund door de Academie van Finland (projectnummers 307335 en 303757) en zonne-energie in de subsidieovereenkomst biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Het protocol is gebaseerd op referentie3.

1. voorbereiding BN Gel1,2,3
<ol><li>De gel-wiel met 8 x 10 cm platen (rechthoekig glas en ingekeepte aluminiumoxide plaat) volgens de instructies van de fabrikant van met behulp van 0,75 mm afstandhouders instellen.</li>
	<li>Plaats een kleurovergang mixer op een roer-plaat en verbind deze met de peristaltische pomp door een slang. Een naald van de spuit hechten aan het andere uiteinde van de...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

De fotosynthetische energie conversie machine bestaat uit grote multisubunit eiwitcomplexen, die zijn ingebed in het membraan van thylakoïde. Dit protocol beschrijft een basismethode voor analyse van de plant thylakoïde eiwitcomplexen van Arabidopsis thaliana met BN-pagina gecombineerd met 2D-SDS-pagina. Het protocol is ook geschikt voor de analyse van eiwitcomplexen thylakoïde van tabak en spinazie ze, maar omvat wellicht kleine aanpassingen.
Voor de solubilisatie van membraan eiw...

Grote multisubunit eiwit complexen Fotosysteem PSI en PSII, Cyt b6f en ATPase coördineren de productie van NADPH en ATP in fotosynthetische licht reacties. In hogere planten chloroplasten, bevinden de complexen zich in de thylakoïde membraan, dat een structureel heterogene membraan structuur is, bestaande uit appressed grana en niet-appressed stroma ze. Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een veel gebruikte methode bij de analyse van grote multisubunit eiwitcomplexen in hun geboorteland en biologisch actieve vorm. De methode werd opgericht voor de dissectie van de mitochondriale membraan eiwit complexen1, maar is later aangepast voor de scheiding van eiwitcomplexen van de thylakoïde membraan netwerk3. De methode is geschikt is (i) voor de zuivering van individuele thylakoïde eiwitcomplexen voor structurele analyse, (ii) voor het bepalen van de inheemse interacties tussen eiwitcomplexen en (iii) voor de analyse van de algemene organisatie van de eiwitcomplexen op het veranderende milieu signalen.
Voorafgaand aan de scheiding, eiwitcomplexen worden geïsoleerd van het membraan met zorgvuldig gekozen nonionic detergentia die zijn over het algemeen mild en de inheemse structuur van de eiwitcomplexen behouden. Wasmiddelen bevatten hydrofobe en hydrofiele sites en de stabiele micellen vorm boven een bepaalde concentratie, een kritische micellaire concentratie (CMC) genoemd. Verhoging van het wasmiddel concentratie boven de CMC-resultaten in verstoring van de lipide-lipide-interacties en de solubilisatie van eiwitcomplexen. De keuze van wasmiddel is afhankelijk van de stabiliteit van het eiwit complex van belang en de capaciteit van de solubilisatie van het wasmiddel. Routinematig gebruikte detergentia omvatten α/β-dodecyl-maltoside en digitonin. Na de solubilisatie van eiwitcomplexen in hun geboortestaat, onoplosbaar materiaal wordt verwijderd door centrifugeren. In hogere planten, het membraan thylakoïde is zeer heterogenic in structuur en sommige wasmiddelen (b.v. digitonin) solubilize selectief slechts een specifiek deel van de membraan-3. Karakteriseren de complexe organisatie van eiwit of de interacties tussen de eiwitcomplexen, is het daarom cruciaal om altijd de solubilisatie capaciteit van het gekozen wasmiddel door het bepalen van de inhoud van de chlorofyl en de chlorofyl a/b verhouding van de bovendrijvende substantie te beoordelen het rendement en de vertegenwoordigde thylakoïde (sub) domein, respectievelijk van de ontbindend breuk. De chlorofyl a/b-verhouding in intact ze van groei-licht acclimated planten is meestal ongeveer 3, terwijl de chl een / b-waarde van thylakoïde breuken verrijkt in grana of stroma ze beneden (~ 2.5) of de waarde van het totaal (~ 4.5) overschrijdt thylakoiden, respectievelijk.
Om negatieve lading aan de eiwitcomplexen, wordt Coomassie briljant blauw (CBB) kleurstof toegevoegd aan het ontbindend monster. Als gevolg van de verschuiving van de lading, eiwitcomplexen migreren naar de anode en worden gescheiden op een helling van acrylamide (AA) volgens hun moleculaire massa en de vorm. Doeltreffend en met hoge resolutie scheiding wordt bereikt met behulp van een lineaire acrylamide concentratie verloop. Tijdens de elektroforese migreren de eiwitcomplexen naar de anode totdat ze hun grootte-afhankelijke porie-grootte limiet is bereikt. De porie-grootte van polyacrylamidegel hangt af van (i) de totale acrylamide /BIB- acrylamide concentratie (T) en (ii) op de cross-linker bis- acrylamide monomeer concentratie (C) ten opzichte van de totale monomeren4. Na de scheiding met BN-pagina, kunnen de eiwitcomplexen worden verder onderverdeeld in hun individuele eiwit subeenheden door tweede-dimensie (2D) - SDS - PAGE. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de analyse van thylakoïde membraan eiwitcomplexen door BN-/ 2D-SDS-pagina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

Fotosynthetische elektron overdracht keten (ETC) omgezet zonne-energie in chemische energie in de vorm van NADPH en ATP. Vier grote eiwitcomplexen ingebed in de thylakoïde membraan oogst zonne-energie rijden elektronen van water naar NADP+ via twee photosystems, en het verloop van de gemaakte proton gebruiken voor productie van ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochroom b6f (Cyt b6f) en ATPase zijn alle multiprotein complexen met verschillende oriëntatie en dynamiek in het membraan van thylakoïde. Waardevolle informatie over de samenstelling en de interacties van de complexen van de eiwitten in het membraan van thylakoïde kan worden verkregen door het solubilizing van de complexen van de membraan integriteit door milde detergentia gevolgd door inheemse gel elektroforetische scheiding van de complexen. Blauwe inheemse polyacrylamide-gel-elektroforese (BN-pagina) is een analytische methode gebruikt voor het scheiden van eiwitcomplexen in hun geboorteland en functionele vorm. De methode kan worden gebruikt voor complexe eiwitreiniging voor meer gedetailleerde structurele analyse, maar het biedt ook een instrument om de dynamische interacties tussen de eiwitcomplexen ontleden. De methode heeft werd ontwikkeld voor de analyse van mitochondriale respiratoire eiwitcomplexen, maar sindsdien zijn geoptimaliseerd en verbeterd voor de dissectie van de thylakoïde eiwitcomplexen. Hier, bieden wij een gedetailleerde up-to-date protocol voor analyse van onstabiele fotosynthetische eiwitcomplexen en hun interacties in Arabidopsis thaliana.

Een representatieve 2D-BN/SDS-pagina systeem in Figuur 1 toont de scheiding tussen digitonin en β-DM-ontbindend thylakoïde eiwitcomplexen en hun gedetailleerde eiwit subeenheid samenstelling. Het eiwit complex patroon van digitonin ontbindend ze (horizontale gel op de bovenkant aan de bovenkant van figuur 1A) bevat de PSII-LHCII-PSI megacomplex, twee grote PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomeer (m)...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Een protocol voor het ontrafelen van plant thylakoïde eiwit complexe organisatie en samenstelling met blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-pagina) en 2D-SDS-pagina wordt beschreven. Het protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis thaliana, maar kan worden gebruikt voor andere plantensoorten met kleine wijzigingen.

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de samenstelling en dynamische organisatie van de fotosynthetische eiwitcomplexen in plant thylakoid membraan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de analyse van functionele interacties tussen inheemse eiwitcomplexen mogelijk maakt en de plasticiteit van de eiwitcomplexe organisatie in wisselende omgevingsomstandigheden opheldert. Stel de gel caster acht centimeter bij 10 centimeter platen volgens de instructies van de fabrikant met behulp van 0,75-millimeter afstandhouders.Plaats een gradiëntmixer op een roerplaat en sluit deze aan bij de peristaltische pomp door buizen te maken. Bevestig een spuitnaald aan de andere kant van de slang en plaats de naald tussen de glas- en aluminiumplaat. Plaats een magnetische roerder in de zware kamer.Bereid 3,5% en 12,5% acrylamide oplossingen in 15-milliliter conische centrifuge buizen zoals beschreven in het tekstprotocol te gebruiken voor de scheiding gel gradiënt. Om vroegtijdige polymerisatie te voorkomen, houdt u de centrifugebuizen op ijs terwijl u de oplossingen voorbereidt. Voeg 5%APS en TEMED toe vlak voordat de oplossingen aan de verloopmixer worden toegevoegd.Pipette de 12,5%-oplossingen voor de zware kamer. Verwijder luchtbellen uit het kanaal dat de licht- en zware kamer verbindt door de klep te openen die de twee kamers verbindt, waardoor de oplossing naar de lichtkamer kan worden ingevoerd. Sluit de klep en pipet de sporen van de oplossing terug naar de zware kamer.Tot slot, pipet de 3,5%-oplossing voor de lichtkamer. Schakel de magneetroerder in. Open de kleppen en schakel de peristaltische pomp in.Laat de geloplossingen tussen de glas- en aluminiumplaat stromen met een stroomsnelheid van ongeveer 0,5 milliliter per minuut. De naald moet te allen tijde boven de vloeistof staan. Wanneer de zware en lichte kamers hebben geleegd vul ze met ultrazuiver water.En laat water om zachtjes overlay de gel oppervlak. Gelpolymeerisatie duurt ongeveer een tot twee uur bij kamertemperatuur. Bereid de 3%acrylamide oplossing voor de stapelgel op kamertemperatuur.Pipette de stapelen gel op de top van de gepolymeriseerde scheiding gel en plaats een monster gel kam tussen het glas en aluminium plaat vermijden luchtbellen. Nadat de gel 30 tot 60 minuten op kamertemperatuur heeft gepolymeriseerd, verwijdert u de kam voorzichtig onder ultrazuiver water. Op dit punt kan de gel worden opgeslagen bij positieve vier graden Celsius in vochtige omstandigheden voor een paar dagen.Verdun geïsoleerde thylakoïden met ijskoude 25BTH20G buffer tot een definitieve chlorofylconcentratie van één milligram per milliliter. Bereid twee buizen voor elk thylakoïde monster om zowel bèta-DM als digitonin oplosbilisatie uit te voeren. Voeg nu een gelijk volume wasmiddel buffer.Meng het wasmiddel en thylakoïde monster voorzichtig met een pipet en vermijd het maken van luchtbellen. Solubilize de thylakoïden gedurende twee minuten op ijs voor de beta-DM oplosbilisatie. Of 10 minuten bij kamertemperatuur met continu zachte mengen op een rocker of shaker voor de digitonin oplosbilisatie.Verwijder na incubatie het onoplosbare materiaal door centrifugatie op 18.000 g gedurende 20 minuten bij positieve vier graden Celsius. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5-milliliter buis en voeg 1/10 volume van Coomassie briljante blauwe buffer aan het monster. Zet de gel in een verticaal elektroforesesysteem.Vul de bovenste bufferkamer met blauwe kathodebuffer en giet anodebuffer naar de onderste bufferkamer. Laad de thylakoïde monsters in de putten. Start de elektroforese en verhoog geleidelijk de spanning zoals vermeld in het tekstprotocol.Voer de gel op positieve vier graden Celsius, hetzij met behulp van een koude kamer of het aanpassen van de gel temperatuur met een koelsysteem. Verander de blauwe kathodebuffer in een duidelijke kathodebuffer wanneer het monsterfront ongeveer 1/3 van de gel heeft gemigreerd. Na de elektroforetische run scan de gel met een fotoscanner voor beeldarchivering.Voor het uitvoeren van 2-SDS PAGE monteren van de verticale elektroforese systeem met behulp van een millimeter afstandhouders. Bereid een standaard SDS gel met een 2D-kam zoals beschreven in het tekstprotocol. Snijd de baan van de BN gel en plaats deze in een buis van vijf milliliter.Voeg vervolgens twee milliliter Laemmli buffer en incubeer de strip gedurende 45 minuten met zachte schudden bij kamertemperatuur. Plaats de baan met behulp van een spacer op de top van de gel het vermijden van luchtbellen. Pipette vijf microliters van moleculair gewicht marker op een smal stuk filter papier en plaats het papier in de standaard put.Om de BN gel strip en de marker papier te verzegelen giet een 0,5%agarose in lopende buffer op de top van de gel strip en laat het stollen. Elektroforese uitvoeren volgens standaardprotocollen. Na de elektroforetische run visualiseren de eiwitten met SUPRO Ruby vlek of zilver vlekken.Representatieve resultaten van thylakoïde eiwitcomplexe patronen van bèta-DM en in opgetallen oplosbaar monsters worden hier weergegeven. De kleine complexen migreren sneller tijdens de elektroforetische run en bevinden zich daarom in het onderste deel van de gel. Terwijl de grote complexen zich in het bovenste deel van de gel bevinden.Digitonin behoudt over het algemeen eiwitcomplexen in grotere samenstellingen, terwijl bèta DM de interacties tussen de complexen interfereert met labiele eiwit-eiwitinteritussen. De subunit samenstelling van eiwitcomplexen van bèta-DM en digitonin-oploskte thylakoïden worden hier gepresenteerd. De subeenheden van elk complex zijn te vinden vanaf de verticale lijn onder het uitgelijnde complex.In principe vertegenwoordigt elke plek in de 2D gel een individueel eiwit. Maar in de praktijk kunnen verschillende eiwitten van dezelfde moleculaire massa op één plek aanwezig zijn. De identificatie van de vlekken is gebaseerd op massaspectrometrie analyse.Na het toepassen van deze procedure kan men met andere methodes zoals elektronenmicroscopie en enige deeltjesanalyse van de eiwitcomplexen voortzetten die van de blauwe inheemse gel worden ontlokt om structurele inzichten in de eiwitcomplexen te krijgen. Om onbekende eiwitsubeenheden te identificeren kunnen de individuele eiwitvlekken van tweedimensionale SDS PAGE worden geanalyseerd met massaspects. Vergeet niet dat het werken met acrylamide en digitonine uiterst schadelijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van beschermende handschoenen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Proteïne-tRNA Agarose Gel Retardatie Assays voor de analyse van de<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA-functie

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...