Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
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Cette recherche a été financée par l’Académie de Finlande (numéros de projet 307335 et 303757) et l’énergie solaire dans la Convention de subvention de la biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Le protocole est basé sur la référence3.

1. préparer le BN Gel1,2,3
<ol><li>Mettre en place le lanceur de sorts de gel avec des plaques de 8 x 10 cm (verre rectangulaire et plaque d’alumine cranté) selon les instructions du fabricant à l’aide de cales d’espacement 0,75 mm.</li>
	<li>Placer une table de mixage dégradé sur une plaque de remuer et raccorder avec la pompe péristaltique par un tube. Attacher une aiguille de se...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

Les machines de conversion d’énergie photosynthétique sont composé de complexes de grandes sous-unités protéiques, qui sont incorporées dans la membrane des thylakoïdes. Ce protocole décrit une méthode de base pour l’analyse des complexes de protéine thylakoïdes plante Arabidopsis thaliana avec BN-PAGE combiné avec 2D-SDS-PAGE. Le protocole est également adapté pour l’analyse des complexes protéiques thylakoïdes des thylakoïdes du tabac et les épinards, mais pourrait nécessiter des petit...

Grandes sous-unités protéiques complexes photosystème PSI et PSII, Cyt b6f et ATPase coordonnent la production de NADPH et d’ATP dans les réactions photosynthétiques de lumière. Dans les chloroplastes de plantes supérieures, les complexes sont situés dans la membrane des thylakoïdes, qui est une structure de membrane structurellement hétérogène, composée de grana accollées et non accolées stroma thylakoïdes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode largement utilisée dans l’analyse des grandes sous-unités protéiques complexes dans leur forme native et biologiquement active. La méthode a été établie pour la dissection de la membrane mitochondriale protéine complexes1, mais plus tard a été personnalisée pour la séparation des complexes protéiques de la membrane thylakoïde réseau3. La méthode est appropriée (i) pour la purification de complexes protéiques thylakoïdes individuels pour l’analyse structurale, (ii) pour determiner natives interactions complexes protéiques et (iii) l’analyse de l’ensemble de l’Organisation des complexes protéiques sur l’évolution des signaux environnementaux.
Avant la séparation, complexes protéiques sont isolées de la membrane avec des détergents non ioniques soigneusement choisis, qui sont généralement bénins et de préserver la structure native des complexes protéiques. Détergents contiennent hydrophobes et hydrophiles sites et micelles stable forme au-dessus d’une certaine concentration, appelée une concentration micellaire critique (CMC). Augmentation de la concentration de détergent au-dessus des résultats de CMC dans la perturbation des interactions lipides-lipides et la solubilisation des complexes protéiques. Le choix du détergent dépend la stabilité de la protéine complexe d’intérêt et les capacités de solubilisation du détergent. Les détergents utilisés couramment sont α/β-dodécyl-maltoside et digitonine. Suite à la solubilisation des complexes de protéines dans leur état natif, matériel insoluble est enlevé par centrifugation. Chez les plantes supérieures, la membrane thylakoïde est hautement hétérogènes dans la structure et certains détergents (p. ex., la digitonine) solubilisent sélectivement seulement une fraction spécifique de la membrane3. Par conséquent, afin de caractériser l’organisation complexe de la protéine ou les interactions entre les complexes de protéine, il est essentiel de toujours déterminer les capacités de solubilisation du détergent choisi par la détermination de la teneur en chlorophylle et la chlorophylle a/b ratio de surnageant pour évaluer le rendement et le domaine représenté thylakoïdes (void), respectivement, de la fraction solubilisée. Le ratio de la chlorophylle a/b dans les thylakoïdes intacts des plantes acclimatées croissance-lumière est généralement autour de 3, alors que la chl un / valeur b des thylakoïdes fractions enrichies en grana ou stroma thylakoïdes inférieure (~ 2,5) ou est supérieure à la valeur du total (~ 4,5) les thylakoïdes, respectivement.
Pour fournir une charge négative pour les complexes de protéine, colorant (CBB) bleu brillant de Coomassie est ajoutée à l’échantillon solubilisé. En raison de l’évolution de la charge, des complexes de protéines migrent vers l’anode et sont séparés sur un gradient d’acrylamide (AA) selon leur masse moléculaire et de la forme. La séparation efficace et à haute résolution est obtenue en utilisant un gradient de concentration d’acrylamide linéaire. Lors de l’électrophorèse, les complexes de protéines migrent vers l’anode jusqu'à ce qu’ils atteignent leur limite de taille de pore dépendant de la taille. Dépend de la taille des pores du gel de polyacrylamide (i) l’acrylamide total / concentration debis- acrylamide (T) et (ii) sur la réticulant bis- acrylamide monomère concentration (C) par rapport à des monomères total4. Après la séparation avec BN-PAGE, les complexes de protéine peuvent être subdivisés en leurs sous-unités de protéine individuelle par seconde dimension (2D) - SDS - PAGE. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’analyse des complexes de protéine de membrane de thylakoid de BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

Chaîne de transfert d’électrons photosynthétiques (etc.) convertit l’énergie solaire en énergie chimique sous forme d’ATP et de NADPH. Quatre complexes de grandes protéines incorporées dans le thylakoïdes membrane récolte l’énergie solaire pour conduire des électrons de l’eau à NADP+ via deux photosystèmes, utilisez le gradient de protons créé pour la production d’ATP. Photosystème PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) et ATPase sont tous des complexes multiprotéiques avec orientation distincte et dynamique dans la membrane des thylakoïdes. On trouvera des informations précieuses sur la composition et les interactions entre les complexes de protéine dans la membrane des thylakoïdes par solubilisation des complexes de l’intégrité de la membrane par des détergents doux, suivies de la séparation par électrophorèse de gel natif du complexes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode d’analyse utilisée pour la séparation des complexes protéiques sous leur forme native et fonctionnelle. La méthode peut être utilisée pour la purification des protéines complexes pour l’analyse structurale plus détaillée, mais il fournit également un outil pour disséquer les interactions dynamiques entre les complexes de protéine. La méthode a été développée pour l’analyse des complexes de protéine respiratoire mitochondriale, mais depuis a été optimisée et améliorée pour la dissection des complexes protéine thylakoïdes. Ici, nous fournissons un protocole à jour détaillé pour l’analyse des complexes de protéine photosynthétique labile et leurs interactions chez Arabidopsis thaliana.

Un système représentatif de 2D-BN/SDS-PAGE à la Figure 1 illustre la séparation de la digitonine et complexes de protéine β-DM-solubilisée thylakoïdes et leur composition de sous-unité protéique détaillée. Le profil complexe protéique de thylakoïdes (gel horizontal en haut sur le dessus de la Figure 1 a) de la digitonine solubilisée contient la mégastructure PSII-LHCII-PSI, deux grandes supercomplexes de PSII-LHCI...

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Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Un protocole pour l’élucidation de l’usine de thylakoïdes organisation complexe de protéines et la composition avec bleu natif polyacrylamide gel électrophorèse (BN-PAGE) et 2D-SDS-PAGE est décrite. Le protocole est optimisé pour l' Arabidopsis thaliana, , mais peut être utilisé pour d’autres espèces de plantes avec des modifications mineures.

Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur la composition et l’organisation dynamique des complexes de protéines photosynthétiques dans la membrane thylakoid végétale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’analyse des interactions fonctionnelles entre les complexes protéiques indigènes et élucide la plasticité de l’organisation complexe protéique dans des conditions environnementales variables. Installez la roulette de gel de huit centimètres par plaques de 10 centimètres selon les instructions du fabricant à l’aide d’espaceurs de 0,75 millimètre.Placez un mélangeur dégradé sur une plaque à remuer et connectez-le à la pompe périssaltique par tube. Fixez une aiguille de seringue à l’autre extrémité du tube et placez l’aiguille entre le verre et la plaque d’aluminium. Placez un agitateur magnétique dans la chambre lourde.Préparez des solutions d’acrylamide à 3,5 % et 12,5 % dans des tubes de centrifugeuse conique de 15 millilitres, comme le détaile le protocole textuel à utiliser pour le gradient gel de séparation. Pour éviter une polymérisation prématurée, gardez les tubes de centrifugeuse sur la glace tout en préparant les solutions. Ajoutez 5% APS et TEMED juste avant de pippetting les solutions au mélangeur de gradient.Pipette les solutions de 12,5% à la chambre lourde. Retirez les bulles d’air du canal reliant la chambre légère et lourde en ouvrant la vanne reliant les deux chambres permettant à la solution d’entrer dans la chambre lumineuse. Fermez la vanne et pipette les traces de solution de retour à la chambre lourde.Enfin, pipette la solution de 3,5% à la chambre légère. Allumez l’agitateur magnétique. Ouvrez les vannes et allumez la pompe périssaltique.Laissez les solutions de gel circuler entre la plaque de verre et d’aluminium à un débit d’environ 0,5 millilitres par minute. L’aiguille doit être au-dessus du liquide en tout temps. Lorsque les chambres lourdes et légères se sont vidées, remplissez-les d’eau ultrapure.Et laisser l’eau superposer doucement la surface du gel. La polymérisation du gel prend environ une à deux heures à température ambiante. Préparer la solution d’acrylamide à 3 % pour le gel empilant à température ambiante.Pipette le gel d’empilage sur le gel de séparation polymérisé et placer un peigne gel échantillon entre le verre et la plaque d’aluminium en évitant les bulles d’air. Après avoir laissé le gel polymériser de 30 à 60 minutes à température ambiante, retirer délicatement le peigne sous de l’eau ultrapure. À ce stade, le gel peut être stocké à quatre degrés Celsius positifs dans des conditions humides pendant quelques jours.Diluer les thylakoids isolés avec un tampon glacé de 25BTH20G à une concentration finale de chlorophylle d’un milligramme par millilitre. Préparez deux tubes pour chaque échantillon de thylakoid pour effectuer la solubilization de bêta-DM et de digitonin. Maintenant, ajoutez un volume égal de tampon détergent.Mélanger délicatement le détergent et l’échantillon de thylakoid avec une pipette et éviter de faire des bulles d’air. Solubiliser les thylakoids pendant deux minutes sur la glace pour la solubilisation bêta-DM. Ou 10 minutes à température ambiante avec mélange doux continu sur un rocker ou shaker pour la solubilisation digitonine.Après l’incubation, enlever le matériau insolubilisé par centrifugation à 18 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius positifs. Transférez le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et ajoutez 1/10 volume de tampon bleu brillant Coomassie à l’échantillon. Installez le gel dans un système d’électrophoresis vertical.Remplissez la chambre tampon supérieure d’un tampon cathodique bleu et versez un tampon d’anode dans la chambre tampon inférieure. Chargez les échantillons de thylakoid dans les puits. Démarrez l’électrophorèse et augmentez progressivement la tension indiquée dans le protocole texte.Faire fonctionner le gel à quatre degrés Celsius positif, soit à l’aide d’une pièce froide, soit en ajustant la température du gel à l’aide d’un système de refroidissement. Modifiez le tampon cathodique bleu en tampon cathodique clair lorsque le front de l’échantillon a migré environ 1/3 du gel. Après la course électrophoretic, numérisez le gel à l’aide d’un scanner photo pour l’archivage d’images.Pour effectuer 2-SDS PAGE assembler le système d’électrophoresis vertical à l’aide d’espaceurs d’un millimètre. Préparez un gel SDS standard avec un peigne 2D tel que décrit dans le protocole texte. Couper la voie à partir du gel BN et la placer dans un tube de cinq millilitres.Ajouter ensuite deux millilitres de tampon Laemmli et incuber la bande pendant 45 minutes avec des secousses douces à température ambiante. Placez la voie à l’aide d’un espaceur sur le gel en évitant les bulles d’air. Pipette cinq microlitres de marqueur de poids moléculaire sur un morceau étroit de papier filtre et placer le papier dans le puits standard.Pour sceller la bande de gel BN et le papier marqueur verser un agarose de 0,5% en cours d’exécution tampon sur le dessus de la bande de gel et lui permettre de se solidifier. Effectuer l’électrophorèse selon les protocoles standard. Après la course électrophoretic visualiser les protéines avec supro ruby tache ou coloration d’argent.Les résultats représentatifs des modèles complexes de protéines thylakoid des échantillons bêta-DM et numérisés-solubilisés sont montrés ici. Les petits complexes migrent plus rapidement pendant la course électrophoretic et sont donc dans la partie inférieure du gel. Alors que les grands complexes sont dans la partie supérieure du gel.La digitonine préserve généralement les complexes protéiques dans les assemblages plus grands, tandis que le bêta DM interfère avec les interactions protéine-protéine labile entre les complexes. La composition sous-unique des complexes protéiques de bêta-DM et de thylakoids numérisés-solubilized sont présentés ici. Les sous-units de chaque complexe se trouvent à partir de la ligne verticale au-dessous du complexe aligné.En principe, chaque tache dans le gel 2D représente une protéine individuelle. Mais dans la pratique, plusieurs protéines de même masse moléculaire peuvent être présentes en un seul endroit. L’identification des taches est basée sur l’analyse de spectrométrie de masse.Après l’application de cette procédure, on peut continuer avec d’autres méthodes comme la microscopie électronique et l’analyse à particule unique des complexes protéiques épuutés du gel natif bleu afin d’obtenir des aperçus structurels dans les complexes protéiques. Pour identifier les sous-unités de protéines inconnues, les taches protéiques individuelles de la PAGE SDS bidimensionnelle peuvent être analysées à l’aide de spécifications de masse. N’oubliez pas que le travail avec l’acrylamide et la digitonine peut être extrêmement nocif et des précautions telles que le port de gants de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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