Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
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Diese Forschung wurde von der Academy of Finland (Projekt-Nummern 307335 und 303757) und Sonnenenergie in Biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie Finanzhilfevereinbarung (675006) finanziell unterstützt. Das Protokoll basiert auf Referenz3.

1. Vorbereitung BN Gel1,2,3
<ol><li>Richten Sie die Gel-Caster mit 8 x 10 cm-Platten (rechteckige Glas- und gekerbten Aluminiumoxid Platte) nach Herstellerangaben mit 0,75 mm spacer.</li>
	<li>Legen Sie einen Gradienten Mischer auf einen rühren Teller und verbinden Sie es mit der peristaltischen Pumpe durch ein Rohr. Das andere Ende des Schlauches eine Spritzennadel beimessen und die Nadel zw...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

Die photosynthetische Energie Umwandlung Maschinen besteht aus großen speziellen Proteinkomplexe, die in die Thylakoidmembran Membran eingebettet sind. Dieses Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode zur Analyse der Pflanze Thylakoidmembran Proteinkomplexe von Arabidopsis Thaliana mit BN-Seite zusammen mit 2D-SDS-PAGE. Das Protokoll eignet sich auch für die Analyse der Thylakoidmembran Proteinkomplexe aus Tabak und Spinat Thylakoids, aber kleine Anpassungen erfordern.
Für die...

Großen speziellen Protein-komplexe Photosystem PSI und PSII, Cyt b6f und ATPase koordinieren die Herstellung von NADPH und ATP in photosynthetischen Licht Reaktionen. In höheren Pflanzen Chloroplasten die komplexe in der Thylakoidmembran Membran befinden sich ein strukturell heterogenen Membran-Struktur, bestehend aus anliegenden Grana und nicht anliegenden Stroma Thylakoids. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine extensiv genutzte Methode bei der Analyse von großen speziellen Proteinkomplexe in ihrer nativen und biologisch aktive Form. Die Methode wurde für die Zerlegung des Mitochondrien-Membran-Protein-komplexe1, aber später für die Trennung von Proteinkomplexen aus der Thylakoidmembran Membran Netzwerk3angepasst wurde. Die Methode eignet sich (i) für die Reinigung der einzelnen Thylakoidmembran Proteinkomplexe für Baustatik, (Ii) zur Bestimmung der native Interaktionen zwischen Proteinkomplexe und (Iii) für die Analyse der Gesamtorganisation der Proteinkomplexe nach dem ändern ökologische Hinweise.
Vor der Trennung sind Proteinkomplexe isoliert von der Membrane mit sorgfältig ausgewählten nichtionische Reinigungsmitteln, die in der Regel mild und bewahren die native Struktur der Protein-komplexe. Waschmittel enthalten hydrophoben und hydrophilen Seiten und Form stabilen Micellen ab einer gewissen Konzentration genannt eine kritische Mizellen Konzentration (CMC). Erhöhung der Waschmittel Konzentration über den CMC-Ergebnissen in Störungen der Lipid-Lipid-Interaktionen und die Solubilisierung von Proteinkomplexen. Die Wahl des Waschmittels hängt von der Stabilität des Proteins von Interesse und die Solubilisierung Kapazität des Waschmittels. Routinemäßig verwendeten Reinigungsmittel sind α/β-Dodecyl-maltosid und Digitonin. Im Anschluss an die Solubilisierung Proteinkomplexe in ihrem nativen Zustand wird unlöslichen Material durch Zentrifugieren entfernt. In höheren Pflanzen die Thylakoidmembran Membran ist sehr heterogene Struktur und einige Reinigungsmittel (z. B. Digitonin) anderweitig selektiv nur einen bestimmten Bruchteil der Membran3. Um die Protein-komplexe Organisation oder die Wechselwirkungen zwischen der Proteinkomplexe zu charakterisieren, ist es daher entscheidend, die Solubilisierung Kapazität des gewählten Waschmittels bestimmen Sie immer durch die Bestimmung der Chlorophyllgehalt und Chlorophyll A/b Verhältnis der überstand den Ertrag und die vertretenen Thylakoidmembran (Sub) Domain bzw. der solubilized Fraktion bewerten. Das Chlorophyll A/b-Verhältnis in intakten Thylakoids Wachstum-Licht gewöhnt Pflanzen ist in der Regel etwa 3, während die Chl ein / b-Wert der Thylakoidmembran Fraktionen bereichert entweder in Grana oder Stroma Thylakoids (~ 2,5) unterschreitet oder überschreitet (~ 4,5) den Wert des gesamten Thylakoids, beziehungsweise.
Um negative Ladung, die Proteinkomplexe zu bieten, wird die solubilized Beispiels Coomassie brillianter blau (CBB) Farbstoff hinzugefügt. Durch die Verschiebung kostenlos Proteinkomplexe in Richtung Anode Wandern und auf einer Steigung von Acrylamid (AA) entsprechend ihrer molekularen Masse und Form getrennt sind. Effektive und hochauflösende Trennung wird mithilfe einer linearen Acrylamid Konzentration Steigung erreicht. Während der Elektrophorese Wandern die Proteinkomplexe in Richtung der Anode bis sie ihre größenabhängige Porengröße Grenze erreichen. Die Porengröße der Polyacrylamid-Gel hängt (i) die gesamte Acrylamid /BIZAcrylamid - Konzentration (T) und (Ii) auf den Vernetzer bis- Acrylamid monomerkonzentration (C) im Verhältnis zu den gesamten Monomere4. Nach der Trennung mit BN-Seite können die Proteinkomplexe weiter durch die zweite Dimension (2D) - SDS - PAGE in ihre einzelnen Protein-Untereinheiten unterteilt werden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch BN-Seite/2D-SDS-PAGE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

Photosynthetische Electron Transfer Kette (usw.) wandelt Sonnenenergie in chemische Energie in Form von NADPH und ATP. Vier große Proteinkomplexe eingebettet in die Thylakoidmembran Membran Ernte Solarenergie Elektronen aus dem Wasser auf NADP+ über zwei photosysteme zu fahren, und die erstellten Proton Steigung für Produktion von ATP. Photosystem PSII, PSI, Cytochrom b6f (Cyt b6d) und ATPase sind alle Multi-komplexe mit eindeutigen Ausrichtung und Dynamik in der Thylakoidmembran Membran. Wertvolle Informationen über die Zusammensetzung und die Interaktionen der Proteinkomplexe in der Thylakoidmembran Membran erhalten Sie durch Gefäss-komplexe aus der Membran Integrität von Feinwaschmittel gefolgt von native Gel elektrophoretische Trennung von der -komplexe. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine analytische Methode für die Trennung der Proteinkomplexe in ihrer nativen und funktionale Form verwendet. Die Methode eignet sich für komplexe Proteinreinigung für genauere strukturelle Analyse, sondern es bietet auch ein Werkzeug, um die dynamischen Wechselwirkungen zwischen der Proteinkomplexe zu sezieren. Die Methode wurde entwickelt für die Analyse der mitochondrialen Atmung Proteinkomplexe, aber seitdem optimiert und verbessert für die Zerlegung der Thylakoidmembran Proteinkomplexe. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll auf dem neuesten Stand für die Analyse der labile photosynthetischen Proteinkomplexe und ihrer Wechselwirkungen in Arabidopsis Thaliana.

Ein repräsentatives 2D-BN/SDS-PAGE-System in Abbildung 1 zeigt die Trennung von Digitonin und β-DM-solubilisiert Thylakoidmembran Proteinkomplexe und ihre detaillierte Proteinzusammensetzung Untereinheit. Das Protein komplexe Muster der Digitonin solubilisiert Thylakoids (horizontale Gel oben auf der Spitze Figur 1A) enthält die PSII LHCII PSI Megacomplex, zwei große PSII LHCII Supercomplexes (sc), PSI-LHCII Supercomplex, PSI...

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Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Ein Protokoll für die Aufklärung der Pflanze Thylakoidmembran Protein komplexe Organisation und Zusammensetzung mit blauen native Polyacrylamid gel-Elektrophorese (BN-Seite) und 2D-SDS-PAGE beschrieben. Das Protokoll ist optimiert für Arabidopsis Thaliana, aber für andere Pflanzenarten mit geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden.

Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die Zusammensetzung und dynamische Organisation der photosynthetischen Proteinkomplexe in der pflanzlichen Thylakoidmembran zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Analyse funktioneller Wechselwirkungen zwischen nativen Proteinkomplexen ermöglicht und die Plastizität der Proteinkomplexorganisation unter unterschiedlichen Umgebungsbedingungen aufklärt. Richten Sie den Gelgießer mit 0,75-Millimeter-Abstandshaltern um acht Zentimeter mal 10 Zentimeter nach Herstelleranleitung ein.Legen Sie einen Gradientenmischer auf eine Rührplatte und verbinden Sie ihn mit der Peristaltikpumpe durch Schläuche. Befestigen Sie eine Spritzennadel am anderen Ende des Schlauches und legen Sie die Nadel zwischen Glas und Aluminiumplatte. Legen Sie einen Magnetrührer in die schwere Kammer.Bereiten Sie 3,5% und 12,5% Acrylamidlösungen in 15-Milliliter-Konifugenröhren vor, wie im Textprotokoll beschrieben, um sie für den Trenngelgradienten zu verwenden. Um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern, halten Sie die Zentrifugenrohre bei der Vorbereitung der Lösungen auf Eis. Fügen Sie 5%APS und TEMED direkt hinzu, bevor Sie die Lösungen an den Gradientenmischer anbringen.Pipette die 12.5%Lösungen für die schwere Kammer. Entfernen Sie Luftblasen aus dem Kanal, der die leichte und schwere Kammer verbindet, indem Sie das Ventil öffnen, das die beiden Kammern verbindet, so dass die Lösung in die Lichtkammer eindringen kann. Schließen Sie das Ventil und pipette die Spuren der Lösung zurück in die schwere Kammer.Schließlich pipette die 3,5%Lösung für die Lichtkammer. Schalten Sie den Magnetrührer ein. Öffnen Sie die Ventile, und schalten Sie die Peristaltikpumpe ein.Lassen Sie die Gellösungen zwischen Glas und Aluminiumplatte mit einer Durchflussrate von etwa 0,5 Milliliter pro Minute fließen. Die Nadel muss sich jederzeit über der Flüssigkeit begeben. Wenn die schweren und leichten Kammern geleert haben, füllen Sie sie mit reinstem Wasser.Und lassen Sie Wasser die Geloberfläche sanft überlagern. Die Gelpolymerisation dauert etwa ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die 3%Acrylamid-Lösung für das Stapelgel bei Raumtemperatur vor.Pipette das Stapelgel auf dem polymerisierten Trenngel und legen Sie einen Probengelkamm zwischen glas- und Aluminiumplatte, um Luftblasen zu vermeiden. Nachdem Das Gel 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur polymerisiert werden kann, entfernen Sie den Kamm vorsichtig unter reinem Reinstwasser. An dieser Stelle kann das Gel bei positiven vier Grad Celsius in feuchten Bedingungen für ein paar Tage gelagert werden.Isolierte Thylakide mit eiskaltem 25BTH20G Puffer auf eine endgültige Chlorophyllkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnen. Bereiten Sie zwei Röhren für jede Thylakoidprobe vor, um sowohl Beta-DM als auch Digitonin-Lösung durchzuführen. Fügen Sie nun ein gleiches Volumen an Waschmittelpuffer hinzu.Mischen Sie das Waschmittel und thylakoid Probe sanft mit einer Pipette und vermeiden Sie Luftblasen. Solubilisieren Sie die Thylakoide für zwei Minuten auf Eis für die Beta-DM-Lösung. Oder 10 Minuten bei Raumtemperatur mit kontinuierlich sanftem Mischen auf einer Wippe oder einem Shaker zur Digitonin-Löslichkeit.Nach der Inkubation das unlösliche Material durch Zentrifugation bei 18 000 g für 20 Minuten bei positiven vier Grad Celsius entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue 1,5-Milliliter-Röhre und fügen Sie der Probe 1/10 Volumen Coomassie-brillanten blauen Puffer hinzu. Richten Sie das Gel in einem vertikalen Elektrophoresesystem ein.Füllen Sie die obere Pufferkammer mit einem blauen Kathodenpuffer und gießen Sie den Anodenpuffer in die untere Pufferkammer. Die Thylakoidproben in die Brunnen laden. Starten Sie die Elektrophorese und erhöhen Sie schrittweise die Spannung, wie im Textprotokoll aufgeführt.Führen Sie das Gel bei positiven vier Grad Celsius entweder mit einem Kühlraum oder mit einem Kühlsystem die Geltemperatur ein. Ändern Sie den blauen Kathodenpuffer in einen klaren Kathodenpuffer, wenn die Probenfront etwa 1/3 des Gels migriert hat. Nach dem elektrophoretischen Lauf scannen Sie das Gel mit einem Fotoscanner zur Bildarchivierung.Um 2-SDS PAGE durchführen, montieren Sie das vertikale Elektrophoresesystem mit einem Millimeter Abstandshaltern. Bereiten Sie ein Standard-SDS-Gel mit einem 2D-Kamm vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie die Spur aus dem BN-Gel und legen Sie es in einem Fünf-Milliliter-Rohr.Dann fügen Sie zwei Milliliter Laemmli Puffer und inkubieren Sie den Streifen für 45 Minuten mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur. Platzieren Sie die Spur mit Hilfe eines Abstandsabstands auf dem Gel, um Luftblasen zu vermeiden. Fünf Mikroliter Molekulargewichtsmarker auf einem schmalen Stück Filterpapier anpfeifen und das Papier in den Standardbrunnen legen.Um den BN-Gelstreifen und das Markerpapier zu versiegeln, gießen Sie eine 0,5%Agarose in Laufpuffer auf den Gelstreifen und lassen Sie ihn erstarren. Elektrophorese nach Standardprotokollen durchführen. Nach dem elektrophoretischen Lauf visualisieren Sie die Proteine mit SUPRO Ruby Fleck oder Silber färbung.Repräsentative Ergebnisse von Thylakoid-Protein-Komplexmustern von Beta-DM- und digitonin-solubilisierten Proben werden hier gezeigt. Die kleinen Komplexe wandern während des elektrophoretischen Laufs schneller und befinden sich daher im unteren Teil des Gels. Während sich die großen Komplexe im oberen Teil des Gels befinden.Digitonin bewahrt proteinkomplexe in größeren Baugruppen in der Regel, während Beta DM die labilen Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen den Komplexen stört. Die Untereinheitszusammensetzung von Proteinkomplexen von Beta-DM und digitonin-solubilisierten Thylakoiden wird hier vorgestellt. Die Untereinheiten jedes Komplexes werden aus der vertikalen Linie unterhalb des ausgerichteten Komplexes gefunden.Grundsätzlich stellt jeder Punkt im 2-D-Gel ein individuelles Protein dar. Aber in der Praxis können mehrere Proteine mit derselben Molekularmasse an einem einzigen Punkt vorhanden sein. Die Identifizierung der Flecken basiert auf einer Massenspektrometrieanalyse.Nach Anwendung dieses Verfahrens kann man mit anderen Methoden wie Elektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse der aus dem blauen nativen Gel eluierten Proteinkomplexe fortfahren, um strukturelle Einblicke in die Proteinkomplexe zu erhalten. Um unbekannte Proteinuntereinheiten zu identifizieren, können die einzelnen Proteinflecken aus zweidimensionalem SDS PAGE mit Massenspezifikation analysiert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Acrylamid und Digitonin extrem schädlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

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Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardations-Assays für die Analyse der<em&gt; N.</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosin TcdA-Funktion

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