Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

מחקר זה מבחינה כלכלית נתמך על ידי האקדמיה של פינלנד (פרוייקט מספרים 307335 ו- 303757) אנרגיה סולארית הסכם גרנט מארי ביומסה (SE2B) הספרותמוזאון (675006). הפרוטוקול מבוסס על התייחסות3.

1. הכנת בסון ג'ל1,2,3
<ol><li>בצע כיוונון גלגלית ג'ל עם לוחות 8 ס"מ x 10 ס"מ (זכוכית מלבני וצלחת אלומינה מחורץ) על פי הוראות היצרן באמצעות מפרידי 0.75 מ מ.</li>
	<li>במקום מערבל צבע על צלחת מערבבים וחבר אותו עם המשאבה ממברנות מאת אבובים. מ?...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

המנגנון המרת אנרגיה פוטוסינתטיים מורכב קומפלקסים גדולים חלבון multisubunit, אשר מוטבעות ממברנה תילקואיד. פרוטוקול זה מתאר שיטה בסיסית לניתוח של מתחמי חלבון תילקואיד צמח מ תודרנית לבנה עם בסון-דף בשילוב עם 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול מתאים גם לניתוח של תילקואיד מתחמי חלבון מן thylakoids טבק ותר...

חלבון multisubunit גדולה קומפלקסים photosystem PSII, Cyt b6f ו- ATPase, גם לתאם בייצור של nadph ל ATP בתגובות אור פוטוסינתטיים. ב מהכלורופלסט צמח גבוה, מתחמי ממוקמים ממברנה תילקואיד, אשר הוא מבנה הממברנה הטרוגנית מבחינה מבנית, הכוללת appressed grana משתית הלא-appressed thylakoids. כחול מקורי לזיהוי בג'ל (בסון-עמוד) היא שיטה בשימוש נרחב בניתוח של חלבון multisubunit גדולה מתחמי בצורתם הטבעית, פעילים ביולוגית. השיטה הוקמה עבור ניתוח ממברנה מיטוכונדריאלי חלבון מתחמי1, אך מאוחר יותר הותאם אישית לצורך הקמת מכשול ההפרדה של חלבון מתחמי תילקואיד רשת קרום, או3. השיטה מתאימה (i) לטיהור של מתחמי חלבון תילקואיד בודדים עבור ניתוח מבנה, (ii) לקביעת יליד אינטראקציות בין חלבונים מתחמי ו- (iii) לניתוח של ארגון הכולל מתחמי חלבון בעת שינוי רמזים סביבתיים.
לפני ההפרדה, מתחמי חלבון מבודדים מן הקרום עם חומרי ניקוי nonionic שנבחרו בקפידה, אשר הם קלים בדרך כלל, לשמר את המבנה המקורי של קומפלקסים חלבונים. חומרי ניקוי מכילים הידרופובי, אתרים הידרופיליות, טופס הקזאין יציב מעל ריכוז מסוים, נקרא ריכוז micellar קריטי (CMC). הגדלת ריכוז דטרגנט שמעל תוצאות CMC שיבוש של אינטראקציות השומנים-השומנים, את solubilization של מתחמי חלבון. הבחירה של דטרגנט תלוי על יציבותו של החלבונים עניין את יכולת solubilization של הנוזל. בשימוש שגרתי דטרגנטים כוללים α/β-dodecyl-maltoside digitonin. בעקבות solubilization של חלבון מתחמי במצבם המקורי, חומרים לא מסיסים יוסר על ידי צנטריפוגה. בצמחים גבוה יותר, קרום תילקואיד מאוד נדלנית במבנה, עכורה (למשל, digitonin) solubilize באופן סלקטיבי רק חלק מסוים של קרום3. לכן, כדי לאפיין הארגון מורכבים חלבון או את האינטראקציות בין מתחמי חלבון, זה קריטי תמיד לקבוע את יכולת solubilization של הנוזל שבחרת על-ידי קביעת התכנים כלורופיל, של כלורופיל / b יחס של תגובת שיקוע לאמוד את התשואה והתחום תילקואיד מייצגים (sub), בהתאמה, של השבר solubilized. היחס כלורופיל / b ב- thylakoids שלם של צמחים acclimated צמיחה-אור הוא בדרך כלל בסביבות 3, ואילו קלוא / b הערך של שברים תילקואיד מועשר או grana או stroma thylakoids יורד מתחת (~ 2.5) או חורג (~ 4.5) את הערך של סה כ thylakoids, בהתאמה.
כדי לספק מטען שלילי מתחמי חלבון, Coomassie (CBB) מבריק צבע כחול נוסף מדגם solubilized. בעקבות שינויי תשלום, חלבון מתחמי נודדים לכיוון האנודה ומופרדים על מעבר צבע אקרילאמיד (AA) על פי מסה מולקולרית והצורה שלהם. ברזולוציה גבוהה ויעילה ההפרדה מושגת באמצעות הדרגה ריכוז אקרילאמיד ליניארי. במהלך אלקטרופורזה, מתחמי חלבון נודדים לכיוון האנודה עד שיגיעו למגבלת גודל הנקבוביות שלהם תלוי בגודל. הנקבובית-הגודל של ג'ל לזיהוי תלוי אקרילאמיד הכולל (i) /bis- אקרילאמיד ריכוז (T) ו- (ii) על מחדש bis- אקרילאמיד מונומר ריכוז (ג) ביחס מונומרים סה כ4. לאחר ההפרדה עם בסון-דף, מתחמי חלבון נוסף נחלקים החלבוניות בודדים שלהם על ידי השנייה-מימד (2D) - מרחביות - דף. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת בסון-/ 2D מרחביות עמוד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

שרשרת העברת אלקטרונים פוטוסינתטיים (וכו ') ממירה אנרגיה סולארית אנרגיה כימית בצורה של nadph ל ו- ATP. ארבעה מתחמי חלבון גדולה מוטבע תילקואיד ממברנה הקציר האנרגיה הסולארית להסיע אלקטרונים מן המים NADP+ ויה photosystems שני, ולהשתמש מעבר הצבע שנוצר פרוטון לייצור ATP. Photosystem PSII, סאי, ציטוכרום b6f (Cyt b6נ) ו- ATPase הם כל מכלולי multiprotein עם אוריינטציה ברורים ואת הדינמיקה בתוך הקרומית תילקואיד. ניתן לקבל מידע חיוני על הרכב ואת האינטראקציות של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד solubilizing את מתחמי מן שלמות הממברנה על ידי חומרי ניקוי עדין ואחריו ג'ל יליד electrophoretic הפרדת מתחמי. כחול מקורי לזיהוי בג'ל (בסון-עמוד) היא שיטה אנליטית משמש הפרדת חלבונים מתחמי בצורתם הטבעית ופונקציונליים. השיטה יכול לשמש עבור חלבון טיהור מורכבים עבור ניתוח מבנה מפורטת יותר, אבל הוא גם מספק כלי כדי לנתח את האינטראקציות דינמי בין מתחמי חלבון. השיטה פותחה עבור הניתוח של מתחמי מיטוכונדריאלי חלבון בדרכי הנשימה, אבל מאז כבר אופטימיזציה, ויש משופרת עבור ניתוח מתחמי חלבון תילקואיד. כאן, אנו מספקים פרוטוקול עדכני מפורט לניתוח של מתחמי חלבון פוטוסינתטיים יציב ואת האינטראקציות שלהם ב תודרנית לבנה.

מערכת 2D-בסון/מרחביות-עמוד נציג באיור 1 מדגים ההפרדה של digitonin וβ-DM-solubilized תילקואיד חלבון מתחמי והרכבן יחידה משנית חלבון מפורט. הדפוס חלבונים מורכבים של digitonin solubilized thylakoids (אופקי ג'ל על גבי בראש איור 1A) מכיל את megacomplex PSII-LHCII-PSI, שני supercomplexes PSII-LHCII ג...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

פרוטוקול עבור הבהרה של הצמח תילקואיד חלבון הארגון מורכבים ו הלחנה אצל כחול לזיהוי יליד ג'ל אלקטרופורזה (בסון-עמוד) ותיאר 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול ממוטבת עבורו תודרנית לבנה, , אבל ניתן להשתמש עבור שאר מיני צמחים עם שינויים מזעריים.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על הרכב וארגון דינמי של קומפלקסים חלבון פוטוסינתטית קרום תילאקואיד הצמח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח של אינטראקציות תפקודיות בין מתחמי חלבון מקומיים ומבהיר את הפלסטיות של הארגון מורכב חלבון בתנאים סביבתיים משתנים. הגדר את גלגלית הג'ל שמונה ס"מ על ידי צלחות 10 ס"מ על פי הוראות היצרן באמצעות 0.75 מילימטר רווחים.מניחים מערבל הדרגתי על צלחת ערבוב ומחברים אותו עם המשאבה peristaltic על ידי צינורות. מחברים מחט מזרק לקצה השני של הצינור ומ מניחים את המחט בין הזכוכית לצלחת האלומיניום. מניחים ערבוב מגנטי בתא הכבד.הכינו פתרונות צנטריפוגה חרוטיים של 3.5% ו-12.5% בצינורות צנטריפוגה חרוטיים של 15 מיליליטר כמפורט בפרוטוקול הטקסט לשימוש עבור שיפוע ג'ל ההפרדה. כדי למנוע פולימריזציה בטרם עת לשמור את צינורות צנטריפוגה על קרח בעת הכנת הפתרונות. הוסף 5%APS ו- TEMED ממש לפני הוספת הפתרונות למיקסר ההדרגתי.פיפטה 12.5% פתרונות לתא הכבד. הסר בועות אוויר מהתעלה המחברת את התא הקל והכבד על ידי פתיחת השסתום המחבר בין שני התאים ומאפשר פתרון להיכנס לתא האור. סגור את השסתום ואת פיפטה עקבות של פתרון בחזרה לתא הכבד.לבסוף, פיפטה פתרון 3.5% לתא האור. הפעל את המערבב המגנטי. פתח את השסתומים, והדליק את המשאבה ההיסטנטית.אפשר לפתרונות הג'ל לזרום בין צלחת הזכוכית לאומיניום בקצב זרימה של כ-0.5 מיליליטר לדקה. המחט חייבת להיות מעל הנוזל בכל עת. כאשר התאים הכבדים והאור התרוקנו, מלאו אותם במים אולטרה-חמים.ולאפשר למים ל כיסוי עדין של משטח הג'ל. פולמריזציה של ג'ל אורכת כשעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. הכינו את פתרון ה-3%acrylamide לג'ל הערימה בטמפרטורת החדר.פיפטה ג'ל הערימה על גבי ג'ל ההפרדה המפולמורת ומ מניחים מסרק ג'ל מדגם בין צלחת הזכוכית ואלומיניום הימנעות בועות אוויר. לאחר מתן אפשרות לג'ל לעשות פולימריזציה במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר, הסר את המסרק בעדינות מתחת למים אולטרה-חמים. בשלב זה ניתן לאחסן את הג'ל בארבע מעלות צלזיוס חיוביות בתנאים לחים במשך כמה ימים.לדלל תיליקואידים מבודדים עם חיץ 25BTH20G קר כקרח לריכוז כלורופיל סופי של מיליגרם אחד למיליליטר. הכינו שני צינורות לכל דגימת תילקואיד לביצוע מינון בטא-DM ודיגיטונין. כעת הוסף אמצעי אחסון שווה של מאגר חומרי ניקוי.מערבבים את חומר הניקוי ואת דגימת תילאקואיד בעדינות עם פיפטה ולהימנע עושה בועות אוויר. מבודדים את התילקואידים לשתי דקות על הקרח לצורך מיזביליזציה של בטא-די-אם. או 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין מתמשך על נדנדה או שייקר עבור מינון דיגיטונין.לאחר הדגירה, להסיר את החומר חד פירעון על ידי צנטריפוגה ב 18, 000 גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס חיובי. העבר את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר והוסף 1/10 נפח של מאגר כחול מבריק קומאסי לדגימה. הגדר את הג'ל במערכת אלקטרופורזה אנכית.מלאו את תא החיץ העליון במאגר קתודה כחול ויוצקים מאגר אנודה לתא החיץ התחתון. טען את דגימות התילקואידים לתוך האטלאקואידים. התחל את האלקטרופורזה והגדל בהדרגה את המתח כמפורט בפרוטוקול הטקסט.הפעל את הג'ל בארבע מעלות צלזיוס חיוביות באמצעות חדר קר או התאמת טמפרטורת הג'ל עם מערכת קירור. שנה את חיץ הקתודה הכחול למאגר קתודיה ברור כאשר חזית הדגימה עברה בערך 1/3 של הג'ל. לאחר הריצה האלקטרופורטית סרוק את הג'ל באמצעות סורק תמונות לאחסון תמונות בארכיון.כדי לבצע דף 2-SDS להרכיב את מערכת אלקטרופורזה אנכית באמצעות מרווחים מילימטר אחד. הכן ג'ל SDS סטנדרטי עם מסרק דו-מיתי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חותכים את הנתיב מג'ל BN ומ מניחים אותו בצינור חמישה מיליליטר.לאחר מכן מוסיפים שני מיליליטר של חיץ Laemmli ו דגירה את הרצועה במשך 45 דקות עם רעידות עדינות בטמפרטורת החדר. מניחים את הנתיב בעזרת מ רווח על גבי הג'ל הימנעות בועות אוויר. פיפטה חמישה מיקרוליטרים של סמן משקל מולקולרי על פיסת נייר מסנן צרה ומ מניחים את הנייר באר הסטנדרטית.כדי לאטום את רצועת הג'ל BN ואת נייר הסמן לשפוך 0.5% agarose במאגר פועל על גבי רצועת ג'ל ולאפשר לו להתגבש. בצע אלקטרופורזה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר הריצה האלקטרופורטית דמיינו את החלבונים עם כתם SUPRO Ruby או כתמי כסף.תוצאות מייצגות של דפוסי חלבון תילקואיד מורכבים של בטא-DM ודגימות מנוזלות דיגיטונין מוצגים כאן. המתחמים הקטנים נודדים מהר יותר במהלך הריצה האלקטרופורטית ולכן נמצאים בחלק התחתון של הג'ל. ואילו המתחמים הגדולים נמצאים בחלק העליון של הג'ל.דיגיטונין בדרך כלל משמר קומפלקסים של חלבונים בהרכבות גדולות יותר, בעוד שבטא DM מפריע לאינטראקציות חלבון-חלבון בין המתחמים. הרכב תת-אחת של קומפלקסים חלבון של בטא-DM ו thylakoids מנוזל דיגיטונין מוצגים כאן. יוניות המשנה של כל קומפלקס נמצאות מהקו האנכי שמתחת למתחם המיושר.באופן עקרוני, כל נקודה בג'ל הדו-מינוני מייצגת חלבון בודד. אבל בפועל, מספר חלבונים מאותה מסה מולקולרית עשויים להיות נוכחים במקום אחד. זיהוי הנקודות מבוסס על ניתוח ספקטרומטריית מסה.לאחר החלת הליך זה ניתן להמשיך בשיטות אחרות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח חלקיקים יחיד של קומפלקס החלבון שחמק מהג'ל הכחול המקומי על מנת לקבל תובנות מבניות על מתחמי החלבון. כדי לזהות תת-יוניות חלבון לא ידועות, ניתן לנתח את כתמי החלבון הבודדים מדף SDS דו-ממדי עם מפרט מסה. אל תשכח כי עבודה עם אקרילאמיד ו digitonin יכול להיות מזיק מאוד אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות מגן תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

פרוטאין tRNA Agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

ג &#39;ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ&quot;א קומפלקסים

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

ניתוח של הפרעה פנימית AtHIRD11 ואיגוד לקראת יוני מתכת על ידי נימי אלקטרופורזה בג'ל אלקטרופורזה נימי זיקה

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...