Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

이 연구 바이오 매스 (SE2B) 마리 Skłodowska 퀴리 부여 계약 (675006)로 핀란드의 아카데미 (프로젝트 번호 307335 및 303757) 및 태양 에너지에 의해 재정적으로 지원 되었다. 프로토콜 참조3를 기반으로 합니다.

1. 준비 비 엔 젤1,2,3
<ol><li>0.75 m m의 스페이서를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 cm x 10 cm 플레이트 (직사각형 유리 및 노치 알 루미나 판)와 젤 캐스터를 설정 합니다.</li>
	<li>그라데이션 믹서를 저 어 접시에 놓고는 배관에 의해 연동 펌프와 연결 합니다. 주사기 바늘 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 ?...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

광합성 에너지 변환 기계 thylakoid 막에 포함 된 큰 multisubunit 단백질 복합물으로 구성 된다. 이 프로토콜 애기 thaliana 2D SDS 페이지와 결합 된 BN 페이지에서 식물 thylakoid 단백질 복합물의 분석을 위한 기본적인 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 또한 담배와 시금치 thylakoids에서 thylakoid 단백질 복합물의 분석에 적합 하지만 작은 조정 해야 할 수도 있습니다.
막 단백질 복합?...

큰 multisubunit 단백질 복합물 photosystem PSI과 PSII, Cyt b6f와 ATPase 광합성 빛 반응에서 ATP와 NADPH의 생산 조정. 더 높은 식물의 엽록체에는 단지는 구조적으로 다른 유형의 막 구조, appressed grana 및 appressed 비 기질 thylakoids thylakoid 막에 있습니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 생물학적 활성 형태로 큰 multisubunit 단백질 복합물의 분석에는 광범위 하 게 사용 되는 방법 이다. 방법1, 미토 콘 드 리아 멤브레인의 단백질 복합물 해 부에 대 한 설립 되었다 하지만 나중 thylakoid 막 네트워크3에서 단백질 복합물의 분리에 대 한 사용자 지정 된. 방법은 (i) 구조 분석, (ii) 단백질 복합물 사이 기본 상호 작용을 결정 하 고 (iii) 단백질 복합물의 전체 조직 분석에 대 한 개별 thylakoid 단백질 복합물의 정화에 적합 시 환경 큐를 변경 합니다.
이전에 분리, 단백질 복합물 신중 하 게 선택한 비 세제는 일반적으로 온화 하 고 단백질 복합물의 기본 구조를 보존 막 으로부터 격리 됩니다. 세제 소수 포함 하 고 친수성 사이트 및 특정 농도, 위의 형태 안정 micelles 라는 중요 한 micellar 농도 (CMC). CMC 결과 지질-지질 상호 작용의 고 단백질 복합물의 가용 화에 세제 농도 증가. 세제의 선택에는 세제의 가용 화 능력 및 관심사의 복잡 한 단백질의 안정성에 따라 달라 집니다. 일상적으로 사용된 세제 α/β-라우릴-maltoside 및 digitonin을 포함합니다. 그들의 네이티브 국가에서 단백질 복합물의 가용 화에 따라 불용 성 물질은 원심 분리에 의해 제거 됩니다. 더 높은 식물에서 thylakoid 막 구조에 매우 heterogenic 이며 일부 세제 (예: digitonin)는 선택적으로 막3의 특정 부분만 solubilize. 따라서, 단백질 복잡 한 조직 또는 단백질 복합물 사이 상호 작용의 특성, 그것은 항상 엽록소 콘텐츠, 엽록소 a/b를 확인 하 여 선택한 세제의 가용 화 능력을 결정 하는 중요 한 상쾌한 solubilized 분수의 수익률 및 대표 thylakoid (하위) 도메인을 각각 평가 비율. 엽록소 a/b 비율 성장 빛 풍토 식물의 그대로 thylakoids에는 일반적으로 약 3, 반면는 chl는 thylakoid 분수의 b 값 grana에 농축 또는 기질 thylakoids (~ 2.5) 미만으로 떨어지면 (~ 4.5) 총의 값 보다 thylakoids, 각각.
단백질 복합물에 부정적인 요금을 제공 하려면 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 염료 solubilized 샘플에 추가 됩니다. 충전 시프트 인해 단백질 복합물 양극 쪽으로 이동 하 고 그들의 분자 질량과 모양에 따라 아크릴 (AA) 그라데이션에 구분 됩니다. 효과적이 고 고해상도 분리 선형 아크릴 아 미드 농도 기온 변화도 사용 하 여 이루어집니다. 전기 이동 법, 동안 그들의 크기에 종속 기 공 크기 제한에 도달할 때까지 단백질 복합물 양극 쪽으로 마이그레이션합니다. Polyacrylamide 젤의 기 공 크기 (i) 총 아크릴에 따라 달라 집니다 /두번째-아크릴 아 미드 농도 (T) 및 (ii) cross-linker 두번째-아크릴 모노 머 농도에 (C) 총 단위체4를 기준으로. BN 페이지와 분리 후 단백질 복합물 수 수 더 세분화 그들의 개별 단백질 소 단위 2 차원 (2D)-SDS-페이지. 여기, 우리는 BN-페이지/2D-SDS-페이지 thylakoid 막 단백질 복합물의 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

광합성 전자 전송 체인 (등) NADPH와 ATP의 형태로 화학 에너지로 태양 에너지를 변환합니다. 4 개의 큰 단백질 복합물 NADP+ photosystems 통해 두, 물에서 전자를 드라이브 하 고 생성된 된 양성자 기온 변화도 사용 하 여 ATP의 생산을 위한 thylakoid 막 수확 태양 에너지에 포함. Photosystem PSII, PSI, 시 토 크롬 b6f (Cyt b6f) 및 ATPase는 뚜렷한 방향과 thylakoid 막에서 역학으로 모든 multiprotein 복합물. 온화한 세제의 기본 젤 전기 이동 별거 다음으로 막 무결성에서 단지 solubilizing 여 구성과 thylakoid 막에서 단백질 복합물의 상호 작용에 대 한 유용한 정보를 얻을 수 있습니다는 단지입니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 기능 형태로 단백질 복합물의 분리에 사용 되는 분석 방법 이다. 자세한 구조 분석을 위해 단백질 복잡 한 정화에 대 한 메서드를 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 또한 단백질 복합물 간의 동적 상호 작용을 해 부를 도구를 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 미토 콘 드리 아 호흡 단백질 복합물의 분석을 위해 개발 되었다 하지만 이후 되었습니다 최적화 있으며 thylakoid 단백질 복합물의 해 부에 대 한 개선. 여기, 우리가 정한 광합성 단백질 복합물 및 애기 thaliana에서 그들의 상호 작용의 분석에 대 한 상세한 최신 프로토콜을 제공합니다.

그림 1 에 대표적인 2D BN/SDS 페이지 시스템 digitonin 및 β-DM solubilized thylakoid 단백질 복합물의 분리 및 그들의 상세한 단백질 소 단위 구성 방법을 보여 줍니다. PSII-LHCII-PSI megacomplex, 2 개의 큰 PSII LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI 단량체 (m), PSII m/Cyt solubilized digitonin thylakoids ( 그림 1A상단 위에 가로 젤)의 단백질 복잡 한 패?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

프로토콜 식물의 해명 thylakoid 단백질 복잡 한 조직 및 구성 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 및 2D SDS 페이지 설명. 애기 thaliana, 프로토콜 최적화 작은 수정으로 다른 식물 종에 대 한 사용할 수 있습니다.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

이 방법은 식물 틸라코이드 막에서 광합성 단백질 복합체의 조성 및 동적 조직에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 토착 단백질 복합체 간의 기능적 상호 작용을 분석할 수 있고 다양한 환경 조건에서 단백질 복합 조직의 가소성을 해명한다는 것입니다. 0.75밀리미터 스페이서를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 젤 캐스터 8센티미터를 10센티미터 플레이트로 설정합니다.교반 판에 그라데이션 믹서를 놓고 튜브를 통해 연동 펌프와 연결합니다. 튜빙의 다른 쪽 끝에 주사기 바늘을 부착하고 유리와 알루미늄 플레이트 사이에 바늘을 놓습니다. 무거운 챔버에 자기 교반기를 놓습니다.분리 젤 그라데이션에 사용하기 위해 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에 3.5% 및 12.5%의 아크릴아미드 솔루션을 준비한다. 적시에 중합을 방지하기 위해 용액을 준비하는 동안 원심 분리관을 얼음 위에 유지합니다. 그라데이션 믹서에 솔루션을 피펫하기 직전에 5%APS와 TEMED를 추가합니다.파이펫 무거운 챔버에 12.5 %의 솔루션. 두 챔버를 연결하는 밸브를 열어 빛과 무거운 챔버를 연결하는 채널에서 기포를 제거하여 용액이 라이트 챔버에 들어갈 수 있도록 합니다. 밸브를 닫고 용액의 흔적을 무거운 챔버로 다시 닫습니다.마지막으로, 3.5%의 용액을 광챔버에 파이펫으로 바합니다. 자기 교반기켜 보입니다. 밸브를 열고 연동 펌프를 켭타보틱 펌프를 켭타보합니다.젤 솔루션이 분당 약 0.5 밀리리터의 유량으로 유리판과 알루미늄 플레이트 사이를 흐르도록 합니다. 바늘은 항상 액체 위에 있어야합니다. 무겁고 가벼운 챔버가 비워지면 초순수물로 채웁니다.그리고 물이 젤 표면을 부드럽게 오버레이할 수 있도록 합니다. 젤 중합은 실온에서 약 1 ~ 2 시간이 걸립니다. 실온에서 스태킹 젤을 위한 3%아크릴아미드 용액을 준비합니다.파이펫은 중합 분리 젤 위에 스태킹 젤을 하고 기포를 피하는 유리판과 알루미늄 판 사이에 샘플 젤 빗을 놓습니다. 실온에서 30~60분 동안 젤을 중합할 수 있게 한 후, 초순수 수중에서 빗을 부드럽게 제거합니다. 이 시점에서 젤은 며칠 동안 습한 조건에서 섭씨 4도 의 양수로 보관할 수 있습니다.얼음 차가운 25BTH20G 버퍼로 격리된 틸라코이드를 밀리리터당 1밀리그램의 최종 엽록소 농도로 희석합니다. 각 틸라코이드 샘플에 대해 두 개의 튜브를 준비하여 베타-DM및 디지토닌 용윤화를 모두 수행합니다. 이제 동일한 양의 세제 버퍼를 추가합니다.세제와 틸라코이드 샘플을 파이펫과 부드럽게 섞어 기포를 만들지 마십시오. 베타-DM 용해화를 위해 얼음 위에 2분 동안 틸라코이드를 용해시합니다. 또는 실온에서 10 분 동안 디지토닌 용해화를 위해 로커 또는 셰이커에 연속 부드러운 혼합이 있습니다.인큐베이션에 따라, 양수 섭씨 4도에서 20분 동안 18, 000g에서 원심분리에 의한 불용성 물질을 제거한다. 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 상체를 옮기고 샘플에 1/10 볼륨의 쿠마시 브릴리언트 블루 버퍼를 추가합니다. 수직 전기 전광 시스템에 젤을 설정합니다.상부 버퍼 챔버를 파란색 음극 버퍼로 채우고 하부 버퍼 챔버에 양극 버퍼를 붓습니다. 틸라코이드 샘플을 우물에 적재합니다. 전기 전도를 시작하고 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 전압을 점차적으로 증가시다.차가운 방을 사용하거나 냉각 시스템으로 젤 온도를 조정하는 양수 섭씨 4도에서 젤을 실행합니다. 샘플 전면이 젤의 약 1/3을 마이그레이션할 때 파란색 음극 버퍼를 명확한 음극 버퍼로 변경합니다. 전기 전광 실행 후 이미지 보관을위한 사진 스캐너와 젤을 스캔합니다.2-SDS PAGE를 수행하려면 1mm 스페이서를 사용하여 수직 전기 전도 시스템을 조립한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 2D 빗으로 표준 SDS 젤을 준비합니다. BN 젤에서 차선을 잘라 5 밀리리터 튜브에 놓습니다.그런 다음 Laemmli 버퍼 2 밀리리터를 추가하고 실온에서 부드러운 흔들림으로 스트립을 45 분 동안 배양하십시오. 기포를 피하는 젤 위에 스페이서의 도움으로 차선을 놓습니다. 좁은 필터 용지에 분자량 마커 5마이크로리터를 피펫하여 종이를 표준에 잘 배치합니다.BN 젤 스트립을 밀봉하고 마커 종이는 겔 스트립 위에 있는 완충제에 0.5%의 아가로즈를 부어 고화시킬 수 있도록 한다. 표준 프로토콜에 따라 전기 전도를 수행합니다. 전기 전광 실행 후 SUPRO 루비 얼룩 또는 은 얼룩으로 단백질을 시각화합니다.베타-DM 및 디지오닌 용해성 샘플의 틸라코이드 단백질 복합 패턴의 대표적인 결과가 여기에 나와 있다. 작은 복합체는 전기 전구 실행 중에 더 빨리 이동하므로 겔의 하부에 있습니다. 큰 복합체는 젤의 상부에 있는 반면.Digitonin은 일반적으로 더 큰 어셈블리에서 단백질 복합체를 보존하고 베타 DM은 복합체 간의 음순 단백질 단백질 상호 작용을 방해합니다. 베타-DM 및 디지오닌 용해성 틸라코이드의 단백질 복합체의 서브유닛 조성물은 여기에서 제시된다. 각 복합체의 하위 단위는 정렬된 복합체 아래의 수직 선에서 찾을 수 있습니다.원칙적으로, 2-D 젤의 각 지점은 개별 단백질을 나타낸다. 그러나 실제로, 동일한 분자 질량의 몇몇 단백질은 단 하나 자리에 존재할 수 있습니다. 반점의 식별은 질량 분석 분석을 기반으로합니다.이 절차를 적용한 후 단백질 복합체에 대한 구조적 통찰력을 얻기 위해 블루 네이티브 젤에서 출동된 단백질 복합체의 전자 현미경 검사법과 단일 입자 분석과 같은 다른 방법을 계속할 수 있다. 알 수 없는 단백질 하위 단위를 식별하기 위해 2차원 SDS PAGE에서 개별 단백질 반점을 질량 사양으로 분석할 수 있다. 아크릴아미드와 디지오닌을 사용하면 매우 해로울 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 보호 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

단백질 분석을위한 Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA 기능

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...