Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Denne forskningen ble økonomisk støttet av Academy i Finland (prosjektnumre 307335 og 303757) og solenergi biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie grant avtale (675006). Protokollen er basert på referanse3.

1. klargjør BN Gel1,2,3
<ol><li>Definere gel caster med 8 cm x 10 cm plater (rektangulær glass og hakk alumina plate) i henhold til produsentens instruksjoner bruke 0,75 mm avstandsstykker.</li>
	<li>Plassere en gradient mikser på en røre tallerken og koble den med peristaltiske pumpen ved et rør. Knytte en sprøyte nål til den andre enden av slangen og plasser nålen mellom glass og alu...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

Fotosynteseaktiviteten energi konvertering maskiner består av store multisubunit protein kompleksene, som er innebygd i thylakoid membranen. Denne protokollen beskriver en grunnleggende metode for analyse av anlegget thylakoid protein komplekser fra Arabidopsis thaliana med BN side kombinert med 2D-SDS-side. Protokollen er også egnet for analyse av thylakoid protein komplekser fra tobakk og spinat thylakoids, men kan kreve små justeringer.
For solubilization av membran protein komp...

Store multisubunit protein komplekser photosystem PSI og PSII, Cyt b6f og ATPase koordinere produksjon av NADPH og ATP i fotosynteseaktiviteten lys reaksjoner. I høyere anlegget chloroplasts ligger komplekser i thylakoid membran, som er et strukturelt heterogene membran struktur, bestående av appressed grana og ikke-appressed stroma thylakoids. Blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) er en mye brukt i analysen av store multisubunit protein komplekser i sin innfødt og biologisk aktive form. Metoden ble etablert for Disseksjon av mitokondrie membran protein komplekser1, men har senere blitt tilpasset for separasjon av protein komplekser fra thylakoid membran nettverk3. Metoden er egnet (i) for rensing av personlige thylakoid protein komplekser for strukturell analyse, (ii) for å bestemme innfødt interaksjoner mellom protein komplekser og (iii) for analyse av organisasjonen av protein komplekser ved endring miljømessige signaler.
Før separasjon er protein komplekser isolert fra membranen med nøye utvalgte ikke-ionisert vaskemidler, som er vanligvis milde og beholde den opprinnelige strukturen av protein komplekser. Vaskemidler inneholder hydrofobe hydrofile områder og skjemaet stabil micelles over en viss konsentrasjon, kalt en kritisk micellar konsentrasjon (CMC). Økende vaskemiddel konsentrasjonen over CMC resultatene i avbrudd av lipid-lipid interaksjoner og solubilization av protein komplekser. Valg av vaskemiddel avhenger stabiliteten av protein kompleks av interesse og solubilization kapasitet vaskemiddel. Rutinemessig brukes vaskemidler inkluderer α/β-dodecyl-maltoside og digitonin. Etter solubilization av protein komplekser i sin opprinnelige tilstand fjernes uløselig materiale med sentrifugering. I høyere planter, thylakoid membranen er svært heterogenic i struktur og legger (f.eks digitonin) solubilize selektivt bare en bestemt del av membran3. Derfor betegner protein kompleks organisasjonen eller samspillet mellom protein komplekser, er det avgjørende å alltid bestemme solubilization kapasiteten til den valgte vaskemiddel ved å bestemme hva klorofyll og klorofyll a/b forholdet mellom nedbryting å vurdere avkastning og representert thylakoid (sub) domene, henholdsvis i solubilized brøken. Klorofyll a/b i intakt thylakoids vekst lys acclimated planter er vanligvis rundt 3, mens chl en / b-verdien av thylakoid fraksjoner beriket i grana eller stroma thylakoids faller under (~ 2,5) eller overskrider (~ 4.5) verdien av totalt thylakoids, henholdsvis.
For å gi negativ ladning til protein komplekser, er Coomassie briljant blå (CBB) fargestoff lagt til solubilized prøven. Følge av kostnad forskyvning, protein komplekser migrere mot anoden og skilles på en akrylamid (AA) gradert etter deres molekylær masse og form. Effektiv og høy oppløsning separasjon er oppnådd ved hjelp av en lineær akrylamid konsentrasjon gradient. Under geleelektroforese migrere protein komplekser mot anoden til de når deres størrelse-avhengige pore-størrelse grense. Pore-størrelse av polyakrylamid gel avhenger av (i) den totale akrylamid /bis- akrylamid konsentrasjon (T) og (ii) på kryss-linker bis- akrylamid monomer konsentrasjonen (C) i forhold til den totale monomerer4. Etter separasjonen BN side, kan protein komplekser videre deles inn i deres personlige protein underenheter andre dimensjon (2D) - SDS - side. Her beskriver vi en detaljert protokoll for analyse av thylakoid membran protein komplekser av BN-side/2D-SDS-side.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

Fotosynteseaktiviteten elektronet transport kjeden (ETC) konverterer solenergi til kjemisk energi i form av NADPH og ATP. Fire store protein komplekser innebygd i thylakoid membran høste solenergi kjøre elektroner fra vann til NADP+ via to photosystems, og bruke opprettet proton gradient for produksjon av ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) og ATPase er alle multiprotein komplekser med forskjellig retning og dynamikk i thylakoid membranen. Verdifull informasjon om sammensetningen og interaksjoner av protein komplekser i thylakoid membranen kan fås ved solubilizing komplekser fra membranen integriteten av milde vaskemidler etterfulgt av innfødte gel electrophoretic separasjon av den komplekser. Blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) er en analytisk metode brukes for separasjon av protein komplekser i sin innfødt og funksjonell form. Metoden kan brukes for protein kompleks rensing for mer strukturelle analysen, men det gir også et verktøy for å analysere dynamisk samspillet mellom protein komplekser. Metoden har ble utviklet for analyse av mitokondrie åndedretts protein komplekser, men siden blitt optimalisert og forbedret for Disseksjon av thylakoid protein komplekser. Her gir vi en detaljert oppdatert protokoll for analyse av labilt fotosynteseaktiviteten protein komplekser og samhandlingen mellom Arabidopsisthaliana.

En representant 2D-BN/SDS-side system i figur 1 viser skillet mellom digitonin og β-DM-solubilized thylakoid protein komplekser og detaljert protein delenhet sammensetningen. Protein kompleks mønster av digitonin solubilized thylakoids (vannrett gel øverst på figur 1A) inneholder PSII-LHCII-PSI megacomplex, to store PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomer (m), PSII m/Cyt b6f, løst bunde...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

En protokoll for utviklingen av anlegget thylakoid protein kompleks organisasjonen og komposisjon med blå innfødt polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) og 2D-SDS-side er beskrevet. Protokollen er optimalisert for Arabidopsis thaliana, , men kan brukes for andre plantearter med mindre modifikasjoner.

Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om sammensetningen og dynamisk organisering av fotosyntetiske proteinkomplekser i plantethylakoid membran. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater analyse av funksjonelle interaksjoner mellom innfødte proteinkomplekser og belyser plastisiteten til den proteinkomplekse organisasjonen under varierende miljøforhold. Sett opp gelkasteren åtte centimeter med 10 centimeter i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av 0,75 millimeter avstandss avstandss.Plasser en gradientmikser på en røreplate og koble den til den peristaltiske pumpen ved å slange. Fest en sprøytenål til den andre enden av slangen og plasser nålen mellom glasset og aluminiumsplaten. Plasser en magnetisk rører i det tunge kammeret.Forbered 3,5% og 12,5% akrylamidløsninger i 15-milliliter koniske sentrifugerør som beskrevet i tekstprotokollen som skal brukes til separasjonsgelgradienten. For å forhindre tidlig polymerisering, hold sentrifugerørene på is mens du forbereder løsningene. Tilsett 5% APS og TEMED rett før pippetting løsningene til gradientmikseren.Pipette de 12,5% løsningene til det tunge kammeret. Fjern luftbobler fra kanalen som forbinder det lyse og tunge kammeret ved å åpne ventilen som forbinder de to kamrene slik at løsningen kan komme inn i lyskammeret. Lukk ventilen og pipette sporene av løsningen tilbake til det tunge kammeret.Til slutt pipette 3,5% løsning til lyskammeret. Slå på den magnetiske røreren. Åpne ventilene, og slå på den peristaltiske pumpen.La gelløsningene strømme mellom glass- og aluminiumsplaten med en strømningshastighet på omtrent 0,5 milliliter per minutt. Nålen må være over væsken til enhver tid. Når de tunge og lette kamrene har tømt fylle dem med ultrapure vann.Og la vann forsiktig legge geloverflaten. Gelpolymerisering tar omtrent en til to timer ved romtemperatur. Forbered 3% akrylamidløsning for stablingsgelen ved romtemperatur.Pipette stabling gel på toppen av polymerisert separasjon gel og plassere en prøve gel kam mellom glass og aluminium plate unngå luftbobler. Etter å ha tillatt gelen å polymerisere i 30 til 60 minutter ved romtemperatur, fjern kammen forsiktig under ultrarent vann. På dette punktet kan gelen lagres ved positiv fire grader Celsius i fuktige forhold i noen dager.Fortynn isolerte thylakoider med iskalde 25BTH20G buffer til en endelig klorofyllkonsentrasjon på ett mg per milliliter. Forbered to rør for hver thylakoid prøve for å utføre både beta-DM og digitonin solubilisering. Legg nå til et likt volum av vaskemiddelbuffer.Bland vaskemiddelet og thylakoidprøven forsiktig med en pipette og unngå å lage luftbobler. Solubilize thylakoids i to minutter på is for beta-DM solubilisering. Eller 10 minutter ved romtemperatur med kontinuerlig skånsom blanding på en rocker eller shaker for digitonin solubilization.Etter inkubasjon fjerner du det insolubiliserte materialet ved sentrifugering ved 18 000 g i 20 minutter ved positiv fire grader Celsius. Overfør det overnaturlige til et nytt 1,5-milliliter rør og legg til 1/10-volumet coomassie strålende blå buffer til prøven. Sett opp gelen i et vertikalt elektroforesesystem.Fyll det øvre bufferkammeret med blå katodebuffer og hell anodebufferen til det nedre bufferkammeret. Last thylakoid prøvene inn i brønnene. Start elektroforesen og øk gradvis spenningen som oppført i tekstprotokollen.Kjør gelen ved positive fire grader Celsius enten ved hjelp av et kaldt rom eller justere geltemperaturen med et kjølesystem. Bytt den blå katodebufferen til en klar katodebuffer når prøvefronten har migrert ca. 1/3 av gelen. Etter elektroforetisk kjøring skanne gelen med en fotoskanner for bildearkivering.For å utføre 2-SDS PAGE montere vertikale elektroforese system ved hjelp av en millimeter avstandss avstandss avstandssyre. Forbered en standard SDS gel med en 2D-kam som beskrevet i tekstprotokollen. Skjær kjørefeltet fra BN gel og legg den i et fem milliliter rør.Tilsett deretter to milliliter Laemmli buffer og inkubere stripen i 45 minutter med mild risting ved romtemperatur. Plasser kjørefeltet ved hjelp av en avstandss avstandss avstand på toppen av gelen og unngå luftbobler. Pipette fem mikroliter av molekylvekt markør på et smalt stykke filterpapir og plassere papiret i standard brønnen.For å forsegle BN gelstripen og markørpapiret hell en 0,5% agarose i løpebuffer på toppen av gelstripen og la den stivne. Utfør elektroforese i henhold til standardprotokoller. Etter elektroforetisk løp visualisere proteiner med SUPRO Ruby flekk eller sølv farging.Representative resultater av thylakoid protein komplekse mønstre av beta-DM og digitonin-solubiliserte prøver er vist her. De små kompleksene migrerer raskere under elektroforetisk løp og er derfor i den nedre delen av gelen. Mens de store kompleksene er i den øvre delen av gelen.Digitonin bevarer vanligvis proteinkomplekser i større forsamlinger, mens beta DM forstyrrer labile protein-protein interaksjoner mellom kompleksene. Underenheten sammensetningen av proteinkomplekser av beta-DM og digitonin-solubilized thylakoids presenteres her. Underenhetene i hvert kompleks finnes fra den vertikale linjen under det justerte komplekset.I prinsippet representerer hvert sted i 2D-gelen et individuelt protein. Men i praksis kan flere proteiner av samme molekylære masse være tilstede på ett sted. Identifiseringen av flekkene er basert på massespektrometrianalyse.Etter å ha brukt denne prosedyren kan man fortsette med andre metoder som elektronmikroskopi og enkeltpartikkelanalyse av proteinkompleksene som er eluted fra den blå innfødte gelen for å få strukturell innsikt i proteinkompleksene. For å identifisere ukjente proteinunderenheter kan de enkelte proteinflekkene fra todimensjonale SDS-side analyseres med massespesifikasjon. Ikke glem at arbeid med akrylamid og digitonin kan være ekstremt skadelig og forholdsregler som bruk av vernehansker bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Karakterisering av Multi-subenheten Protein Komplekser av menneskelig MXA bruk av ikke-denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for Analyse av<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -treonylkarbamoyladenosin TcdA-funksjon

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysere superkomplekser av den mitokondriale elektrontransportkjede med innfødte elektroforese, in-gel-analyser og elektrolysering

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese for forbedret deteksjon av protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet analysen med nær-infrarøde fluorescerende merket DNA visualisert ved akrylamid Gel geleelektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID-Proteomic analyse av kontekstavhengige Protein komplekser i sitt opprinnelige mobilnettet miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse av AtHIRD11 iboende forstyrrelse og bindende mot metall ioner av kapillær Gel gelelektroforese og affinitet kapillært geleelektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...