Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pela Academia da Finlândia (números do projeto 307335 e 303757) e Energia Solar no acordo de subvenção de biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). O protocolo é baseado na referência3.

1. preparar BN1,2,3 do Gel
<ol><li>Configure o rodízio de gel com placas de 8 x 10 cm (vidro retangular e placa entalhada da alumina) de acordo com as instruções do fabricante usando espaçadores de 0,75 mm.</li>
	<li>Coloque num prato de agitar um mixer gradiente e conectá-lo com a bomba peristáltica por uma tubulação. Anexar uma agulha da seringa para a outra extremidade do tubo e col...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

As máquinas de conversão de energia fotossintética é composta por grandes multisubunit complexos de proteínas, que são encaixados na membrana tilacoides. Este protocolo descreve um método básico para análise dos complexos proteína vegetal tilacoides de Arabidopsis thaliana com BN-página combinada com 2D-SDS-PAGE. O protocolo é também adequado para a análise de complexos de proteínas tilacoides de tabaco e espinafre contém, mas pode precisar de pequenos ajustes.
Para a ...

Proteína multisubunit grandes complexos fotossistema PSI e PSII, Cyt b6f e ATPase coordenam a produção de NADPH e ATP em reações de luz fotossintéticas. Nos cloroplastos de plantas superiores, os complexos estão localizados na membrana tilacoides, que é uma estrutura de membrana estruturalmente heterogêneo, composto por grana apresso e não-apresso estroma contém. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método amplamente utilizado na análise de grandes multisubunit complexos de proteínas em sua forma nativa e biologicamente ativo. O método foi criado para a dissecção da proteína de membrana mitocondrial complexos1, mas mais tarde foi personalizado para a separação dos complexos da proteína da membrana tilacoides rede3. O método é adequado (i) para a purificação de complexos de proteínas tilacoides individuais para análise estrutural, (ii) para determinar o nativas interações entre complexos de proteína e (iii) a análise da organização geral dos complexos da proteína Após alterar as sugestões ambientais.
Antes da separação, complexos da proteína são isolados da membrana com detergentes não iônicos cuidadosamente escolhidos, que são geralmente leves e preservar a estrutura nativa dos complexos da proteína. Detergentes contêm hidrofóbicos e hidrofílicos sites e micelas estável de forma acima de uma determinada concentração, chamado uma concentração crítica de micellar (CMC). Aumentando a concentração de detergente acima dos resultados CMC no rompimento das interações lipid-lipídico e a solubilização dos complexos da proteína. A escolha do detergente depende a estabilidade da proteína complexa de interesse e a capacidade de solubilização de detergente. Rotineiramente utilizados detergentes incluem α/β-dodecil-maltoside e digitonin. Após a solubilização dos complexos de proteína no seu estado nativo, material insolúvel é removido por centrifugação. Em plantas superiores, a membrana tilacoides é altamente heterogêneo em estrutura e alguns detergentes (por exemplo, digitonin) solubilizar seletivamente apenas uma fração específica da membrana3. Portanto, para caracterizar as interações entre os complexos de proteína ou proteína complexa organização, é crucial determinar sempre a capacidade de solubilização de detergente escolhido, determinando-se o teor de clorofila e a clorofila a/b relação de sobrenadante para avaliar o rendimento e o domínio representado tilacoides (sub), respectivamente, da fração solubilized. A clorofila a/b relação contém intacta de crescimento-luz acclimated plantas normalmente é em torno de 3, Considerando que a chl um / b valor de tilacoides frações enriquecidas em grana ou estroma contém cai abaixo (~ 2.5) ou superior (~ 4,5) o valor do total contém, respectivamente.
Para fornecer uma carga negativa para os complexos de proteína, a tintura de (CBB) azul brilhante de Coomassie é adicionada à amostra solubilized. Devido a mudança de carga, complexos de proteínas migram para o ânodo e são separados em um gradiente de acrilamida (AA) de acordo com sua massa molecular e a forma. Separação eficaz e de alta resolução é conseguida usando um gradiente de concentração de acrilamida linear. Durante a eletroforese, os complexos de proteína migram para o ânodo até atingirem o limite de tamanho de poro dependente do tamanho. O tamanho dos poros do gel de polyacrylamide depende (i) a acrilamida total /bis- acrilamida concentração (T) e (ii) sobre a cross-linker bis- acrilamida monômero concentração (C) em relação a monômeros total4. Após a separação com BN-página, os complexos de proteína podem ser subdivididos em suas subunidades de proteínas individuais por segunda dimensão (2D) - SDS - PAGE. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por BN-página/2D-SDS-PAGE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

Cadeia de transferência de elétrons fotossintética (ETC) converte energia solar em energia química na forma de NADPH e ATP. Quatro grandes complexos de proteínas incorporado em tilacoides membrana colheita solar energia para conduzir os elétrons da água para NADP+ através de dois fotossistemas e usar o gradiente de prótons criado para a produção de ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b6f (Cyt b6f) e ATPase são todos os complexos Multiproteicos com orientação distinta e dinâmica na membrana tilacoides. Informações valiosas sobre a composição e as interações dos complexos proteína na membrana tilacoides podem ser obtidas pelo solubilizing os complexos da integridade da membrana por detergentes suaves, seguidos pelo nativo gel de separação eletroforética do complexos. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método analítico usado para a separação de complexos de proteínas em sua forma nativa e funcional. O método pode ser usado para purificação de complexo de proteínas para análise estrutural mais detalhada, mas ele também fornece uma ferramenta para dissecar as interações dinâmicas entre os complexos de proteína. O método foi desenvolvido para a análise de complexos de proteína respiratória mitocondrial, mas desde então foi otimizado e melhorado para a dissecação dos complexos proteína tilacoides. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado atualizado para análise de complexos de proteínas fotossintéticas lábeis e suas interações em Arabidopsis thaliana.

Um sistema representativo de 2D-BN/SDS-PAGE na Figura 1 demonstra a separação de digitonin e complexos de proteína β-DM-solubilizado tilacoides e sua composição de subunidade de proteína detalhadas. O padrão complexo de proteínas de digitonin solubilizado contém (gel de horizontal na parte superior no topo da figura 1A) contém a megacomplex do FSII LHCII-PSI, duas grandes razões do FSII-LHCII (sc), supercomplex PSI-LH...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Um protocolo para a elucidação da planta tilacoides proteína complexa organização e composição com poliacrilamida nativa azul gel eletroforese (BN-página) e 2D-SDS-PAGE é descrito. O protocolo é otimizado para a Arabidopsis thaliana, , mas pode ser usado para outras espécies de plantas com pequenas modificações.

Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a composição e organização dinâmica dos complexos proteicos fotossintéticos na membrana de tirokoóide vegetal. A principal vantagem dessa técnica é que permite a análise das interações funcionais entre complexos proteicos nativos e elucida a plasticidade da organização do complexo proteico em diferentes condições ambientais. Configure o rodízio de gel de oito centímetros por placas de 10 centímetros de acordo com as instruções do fabricante usando espaçadores de 0,75 milímetros.Coloque uma batedeira de gradiente em uma placa de mexida e conecte-a com a bomba peristáltica por tubo. Coloque uma agulha de seringa na outra extremidade da tubulação e coloque a agulha entre o vidro e a placa de alumínio. Coloque um agitador magnético na câmara pesada.Prepare soluções de centrífugo de 3,5% e 12,5% em tubos de centrífuga cônica de 15 mililitros, conforme detalhado no protocolo de texto a ser usado para o gradiente de gel de separação. Para evitar a polimerização prematura, mantenha os tubos de centrífugas no gelo enquanto prepara as soluções. Adicione 5%APS e TEMED logo antes de pippetar as soluções para o misturador de gradiente.Pipetizar as soluções de 12,5% para a câmara pesada. Remova bolhas de ar do canal que conecta a câmara leve e pesada, abrindo a válvula que conecta as duas câmaras permitindo que a solução entre na câmara de luz. Feche a válvula e pipeta os traços da solução de volta para a câmara pesada.Por fim, pipete a solução de 3,5% para a câmara de luz. Ligue o agitador magnético. Abra as válvulas e ligue a bomba peristáltica.Permita que as soluções de gel fluam entre o vidro e a placa de alumínio a uma taxa de fluxo de aproximadamente 0,5 mililitros por minuto. A agulha deve estar acima do líquido o tempo todo. Quando as câmaras pesadas e leves esvaziarem-nas enchem-nas com água ultrapura.E deixe a água sobrepor suavemente a superfície do gel. A polimerização do gel leva cerca de uma a duas horas em temperatura ambiente. Prepare a solução de acrilamida de 3% para o gel de empilhamento à temperatura ambiente.Pipete o gel de empilhamento em cima do gel de separação polimerizada e coloque um pente de gel de amostra entre o vidro e a placa de alumínio evitando bolhas de ar. Depois de permitir que o gel polimerize por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente, remova o pente suavemente sob água ultrauso. Neste ponto o gel pode ser armazenado a 4 graus Celsius positivos em condições úmidas por alguns dias.Diluir timilóides isolados com tampão 25BTH20G frio para uma concentração final de clorofila de um miligrama por mililitro. Prepare dois tubos para cada amostra de tirokoide para realizar tanto beta-DM quanto solubilização de digitonina. Agora adicione um volume igual de tampão de detergente.Misture o detergente e a tirola imola com uma pipeta e evite fazer bolhas de ar. Solubilize as tireilakoidas por dois minutos no gelo para a solubilização beta-DM. Ou 10 minutos em temperatura ambiente com mistura suave contínua em um roqueiro ou agitador para a solubilização digitonin.Após a incubação, remova o material insolubilizado por centrifugação a 18.000 g durante 20 minutos a 4 graus positivos Celsius. Transfira o supernante para um novo tubo de 1,5 mililitro e adicione 1/10 de tampão azul brilhante Coomassie à amostra. Coloque o gel em um sistema de eletroforese vertical.Encha a câmara tampão superior com tampão de cátodo azul e despeje o tampão de ânodo na câmara tampão inferior. Coloque as amostras de tirocoide nos poços. Inicie a eletroforese e aumente gradualmente a tensão conforme listado no protocolo de texto.Execute o gel a 4 graus Celsius positivos usando uma sala fria ou ajustando a temperatura do gel com um sistema de resfriamento. Altere o tampão do cátodo azul para um tampão de cátodo claro quando a frente da amostra migrar cerca de 1/3 do gel. Após a execução eletroforética, escaneie o gel com um scanner fotográfico para arquivamento de imagens.Para executar 2-SDS PAGE monte o sistema de eletroforese vertical usando espaçadores de um milímetro. Prepare um gel SDS padrão com um pente 2D descrito no protocolo de texto. Corte a pista do gel BN e coloque-a em um tubo de cinco mililitros.Em seguida, adicione dois mililitros de tampão laemmli e incubar a tira por 45 minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Coloque a pista com a ajuda de um espaçador em cima do gel evitando bolhas de ar. Pipeta cinco microliters de marcador de peso molecular em um pedaço estreito de papel filtro e colocar o papel no poço padrão.Para selar a tira de gel BN e o papel marcador despeje uma 0,5% de agarose na execução do buffer em cima da tira de gel e permita que ela se solidifique. Realize eletroforese de acordo com os protocolos padrão. Após a corrida eletroforética visualize as proteínas com mancha de RUBI SUPRO ou coloração de prata.Resultados representativos de padrões complexos de proteínas de tiroilakoide de beta-DM e amostras de digitonina-solubilizada são mostrados aqui. Os pequenos complexos migram mais rápido durante a corrida eletroforética e, portanto, estão na parte inferior do gel. Enquanto os grandes complexos estão na parte superior do gel.A digitonina geralmente preserva complexos proteicos em conjuntos maiores, enquanto o DM beta interfere com interações proteína-proteína labile entre os complexos. A composição subunidade de complexos proteicos de beta-DM e thylakoids digitalonin-solubilizadas são apresentadas aqui. As subunidades de cada complexo são encontradas a partir da linha vertical abaixo do complexo alinhado.Em princípio, cada ponto no gel 2D representa uma proteína individual. Mas, na prática, várias proteínas da mesma massa molecular podem estar presentes em um único ponto. A identificação das manchas baseia-se na análise de espectrometria de massa.Após a aplicação deste procedimento pode-se continuar com outros métodos como microscopia eletrônica e análise de partículas únicas dos complexos proteicos eludidos do gel nativo azul, a fim de obter insights estruturais sobre os complexos proteicos. Para identificar subunidades proteicas desconhecidas, os pontos proteicos individuais do SDS PAGE bidimensional podem ser analisados com especificação de massa. Não se esqueça que trabalhar com acrilamida e digitonina pode ser extremamente prejudicial e precauções como o uso de luvas de proteção devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Ensaios de Retardamento de Gel de Agarose Protein-tRNA para Análise do<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonilcarbamoyladenosina TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Análise de AtHIRD11 desordem intrínseca e ligação para íons metálicos por eletroforese em Gel capilar e afinidade de eletroforese capilar

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...