Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Denna forskning stöddes ekonomiskt av Finlands Akademi (projektnummer 307335 och 303757) och solenergi i biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie bidragsavtalet (675006). Protokollet är baserat på referens3.

1. förbereda BN Gel1,2,3
<ol><li>Ställa in gel caster med 8 x 10 cm plattor (rektangulära glas och spårat aluminiumoxid plattan) enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av 0,75 mm distanser.</li>
	<li>Placera en gradient mixer på en uppståndelse tallrik och ansluta den med den peristaltiska pumpen genom en slang. Bifoga en sprutans nål till den andra änden av slangen och placera n?...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

Fotosyntetiska energi konvertering maskiner består av stora multisubunit proteinkomplex, som är inbäddade i membranet som tylakoida. Det här protokollet beskriver en grundläggande metod för analys av de växt tylakoida proteinkomplex från Arabidopsis thaliana med BN-sida kombinerat med 2D-SDS-PAGE. Protokollet är också lämplig för analys av tylakoida proteinkomplex från tobak och spenat thylakoids, men kan kräva små justeringar.
För lösbarhet av membran proteinkomplex ...

Stora multisubunit protein komplex fotosystem PSI och PSII, Cyt b6f och ATPas samordna produktionen av NADPH och ATP i fotosyntetiska ljus reaktioner. I högre växt kloroplaster, är komplexen belägna i det tylakoida membranet, som är en strukturellt heterogena membranstruktur, bestående av appressed grana och icke-appressed stroma thylakoids. Blå infödda polyakrylamid gelelektrofores (BN-sidan) är en omfattande metod i analysen av stora multisubunit proteinkomplex i deras infödda och biologiskt aktiva form. Metoden var etablerat för dissektion av mitokondriella membranet protein komplex1, men senare har anpassats för separation av proteinkomplex från tylakoida membran nätverk3. Metoden är lämplig för rening av enskilda tylakoida proteinkomplex för strukturanalys, (ii) för att fastställa infödd interaktioner mellan proteinkomplex och (iii) för analys av övergripande organisation av proteinkomplex vid förändras miljön ledtrådar.
Innan separationen är proteinkomplex isolerade från membranet med noga utvalda Nonjonaktivt rengöringsmedel, som är vanligtvis milda och bevara den ursprungliga strukturen av proteinkomplex. Tvättmedel innehåller hydrofoba och hydrofil platser och bildar stabila miceller över en viss koncentration, kallas en kritisk micellar koncentration (CMC). Ökar den tvättmedel koncentrationen över CMC resultaten i störningar av lipid-lipid interaktioner och lösbarhet av proteinkomplex. Valet av tvättmedel beror på stabiliteten av protein komplex av intresse och lösbarhet kapacitet av tvättmedel. Rutinmässigt används rengöringsmedel inkluderar α/β-dodecyl-maltoside och digitonin. Efter lösbarhet av proteinkomplex i sitt ursprungliga tillstånd, olösligt material tas bort genom centrifugering. I högre växter, tylakoida membranet är mycket heterogen struktur och vissa rengöringsmedel (t.ex. digitonin) solubilize selektivt bara en specifik del av membran3. För att karakterisera den protein komplex organisationen eller samspelet mellan proteinkomplex, är det därför avgörande att alltid bestämma lösbarhet kapaciteten av det valda tvättmedlet genom att bestämma halten klorofyll och klorofyll a/b förhållandet av supernatanten att bedöma avkastningen och den föreställda tylakoida (sub) domänen, respektive av den solubilized fraktionen. Klorofyll a/b förhållandet i intakt thylakoids av tillväxt-ljus acklimatiserad växter är vanligen omkring 3, medan chl en / b värdet av tylakoida fraktioner berikad antingen i grana eller stroma thylakoids understiger (~ 2,5) eller överskrider (~ 4.5) värdet av totalen thylakoids, respektive.
För att ge negativ laddning till proteinkomplex, tillsätts Coomassie brilliant blue (CBB) färgämne solubilized provet. På grund av kostnad skiftet, proteinkomplex migrera mot anoden och separeras på en akrylamid (AA) lutning enligt deras molekylärt samlas och form. Effektiv och högupplösta separation uppnås med hjälp av en linjär akrylamid koncentrationsgradient. Under elektrofores migrera proteinkomplex mot anoden tills de når sin storlek-beroende porstorlek gräns. Polyakrylamidgelen por-storlek beror på (i) den totala akrylamid /bis- akrylamid koncentration (T) och (ii) på cross-linker bis- akrylamid monomer koncentrationen (C) i förhållande till den totala monomerer4. Efter separationen med BN-sida, kan proteinkomplex ytterligare delas in i deras individuella proteinsubenheter med andra-dimension (2D) - SDS - PAGE. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för analys av tylakoida membran proteinkomplex av BN-/ 2D SDS sida.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

Fotosyntetiska elektron överföringen kedjan (ETC) omvandlar solenergi till kemisk energi i form av NADPH och ATP. Fyra stora proteinkomplex inbäddad i den tylakoida membran skörd solenergin att köra elektroner från vatten till NADP+ via två fotosystem och använda den skapade Protonlutning för produktion av ATP. Photosystem PSII, PSI, cytokrom b6f (Cyt b6f) och ATPas är alla multiprotein komplex med distinkta orientering och dynamiken i tylakoida membran. Värdefull information om sammansättning och interaktioner av proteinkomplex i tylakoida membran kan erhållas genom solubilizing komplex från membran integriteten av milda tvättmedel följt av infödda gel elektroforetisk separation av de komplex. Blå infödda polyakrylamid gelelektrofores (BN-sidan) är en analysmetod som används för separation av proteinkomplex i deras infödda och funktionell form. Metoden kan användas för protein komplex rening för mer detaljerad strukturanalys, men det ger också ett verktyg för att dissekera dynamiska samspelet mellan proteinkomplex. Metoden har utvecklades för analys av mitokondrie respiratoriska proteinkomplex, men sedan dess optimerad och förbättrats för dissekering av tylakoida proteinkomplex. Här ger vi en detaljerad aktuell protokoll för analys av labila fotosyntetiska proteinkomplex och deras interaktioner i Arabidopsis thaliana.

En representativ 2D-BN/SDS-PAGE-systemet i figur 1 visar separering av digitonin och β-DM-solubilized tylakoida proteinkomplex och deras detaljerade protein subenhet sammansättning. Den protein komplexa mönstret av digitonin solubilized thylakoids (horisontella gel överst på toppen av figur 1A) innehåller PSII-LHCII-iska megacomplex, två stora PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomerer (m), PSII ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Ett protokoll för förtydligandet av växten tylakoida protein komplex organisation och sammansättning med blå infödda polyakrylamid gel elektrofores (BN-sidan) och 2D-SDS-PAGE beskrivs. Protokollet är optimerad för Arabidopsis thaliana, men kan användas för andra växtarter med smärre ändringar.

Analys av Thylakoid membran proteinkomplex med blå infödda gelelektrofores

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor om sammansättning och dynamisk organisation av de fotosyntetiska proteinkomplex i växt thylakoid membran. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör analys av funktionella interaktioner mellan inhemska proteinkomplex och klarrar den proteinkomplexliga organisationens plasticitet i varierande miljöförhållanden. Ställ in gelen caster åtta centimeter med 10-centimeter plattor enligt tillverkarens instruktioner med hjälp av 0,75-millimeters distanser.Placera en gradientblandare på en omrörningsplatta och anslut den med peristaltisk pump genom slang. Fäst en spruta nål på andra änden av slangen och placera nålen mellan glas och aluminiumplatta. Placera en magnetisk omrörare i den tunga kammaren.Förbered 3,5%och 12,5%akrylamidlösningar i 15-milliliter koniska centrifugrör som närmare i textprotokollet som ska användas för separationsgelgradienten. För att förhindra att polymerisering i otid håller centrifugrören på is samtidigt som lösningarna förbereds. Lägg till 5%APS och TEMED precis innan du pippettar lösningarna till övertoningsblandaren.Pipettera de 12,5%lösningarna till den tunga kammaren. Avlägsna luftbubblor från den kanal som förbinder ljuset och den tunga kammaren genom att öppna ventilen som förbinder de två kamrarna så att lösning kan komma in i ljuskammaren. Stäng ventilen och pipetten spåren av lösning tillbaka till den tunga kammaren.Slutligen pipettera 3,5%-lösningen till ljuskammaren. Koppla på magnetomröraren. Öppna ventilerna, och slå på peristaltisk pump.Låt gellösningarna flöda mellan glas- och aluminiumplattan med en flödeshastighet på ungefär 0,5 milliliter per minut. Nålen måste vara över vätskan hela tiden. När de tunga och lätta kamrarna har tömts fyll dem med ultrarent vatten.Och låt vatten försiktigt överlagra gelytan. Gelpolymerisering tar ungefär en till två timmar i rumstemperatur. Förbered 3%akrylamidlösningen för staplingsgelen i rumstemperatur.Pipettera staplingsgelen ovanpå den polymeriserade separationsgelen och placera en provgelkam mellan glas- och aluminiumplattan som undviker luftbubblor. Efter att gelén har tillåtits polymerisera i 30 till 60 minuter vid rumstemperatur, avlägsna kammen försiktigt under ultrarent vatten. Vid denna punkt gelen kan lagras vid positiva fyra grader Celsius i fuktiga förhållanden för ett par dagar.Späd isolerade thylakoider med iskall 25BTH20G buffert till en slutlig klorofyll koncentration av ett milligram per milliliter. Förbered två rör för varje thylakoidprov för att utföra både beta-DM och digitonin solubilization. Nu lägga till en lika volym av rengöringsmedel buffert.Blanda diskmedlet och thylakoidprovet försiktigt med en pipett och undvik att göra luftbubblor. Solubilisera thylakoiderna i två minuter på is för beta-DM solubilisering. Eller 10 minuter i rumstemperatur med kontinuerlig skonsam blandning på en vipp eller shaker för digitonin solubilization.Efter inkubation, ta bort det insolubilized materialet genom centrifugeringen vid 18, 000 g i 20 minuter vid positiva fyra grader Celsius. Överför supernatanten till ett nytt 1,5-milliliterrör och tillsätt 1/10 volym Coomassie briljantblå buffert till provet. Ställ in gelen i ett vertikalt elektroforessystem.Fyll den övre buffertkammaren med blå katodbuffert och häll anodbuffert till den nedre buffertkammaren. Lasta in thylakoidproverna i brunnarna. Starta elektroforesen och öka spänningen gradvis enligt textprotokollet.Kör gelen vid positiva fyra grader Celsius antingen med hjälp av ett kylrum eller justera geltemperaturen med ett kylsystem. Ändra den blå katodbufferten till en klar katodbuffert när provfronten har migrerat ca 1/3 av gelen. Efter den elektroforetiska kör skanna gelen med en fotoskanner för bild arkivering.För att utföra 2-SDS PAGE montera det vertikala elektroforessystemet med hjälp av en millimeters distanser. Förbered en SDS-standardgel med en 2D-kam enligt beskrivningen i textprotokollet. Klipp av körfältet från BN-gelen och placera den i ett fem-milliliterrör.Tillsätt sedan två milliliter Laemmli buffert och inkubera remsan i 45 minuter med mild skakning vid rumstemperatur. Placera körfältet med hjälp av ett distanser ovanpå gelen undvika luftbubblor. Pipetter fem mikroliter av molekylviktsmarkör på ett smalt stycke filterpapper och placera papperet i standard brunnen.För att täta BN-gelremsan och markörpapperet häll en 0,5%-agaros i löpbuffert ovanpå gelremsan och låt den stelna. Utför elektrofores enligt standardprotokoll. Efter den elektroforetiska körningen visualisera proteinerna med SUPRO Ruby fläck eller silver färgning.Representativa resultat av thylakoid protein komplexa mönster av beta-DM och digitonin-solubilized prover visas här. De små komplexen vandrar snabbare under den elektroforetiska körningen och är därför i den nedre delen av gelen. Medan de stora komplexen är i den övre delen av gelén.Digitonin bevarar i allmänhet proteinkomplex i större sammansättningar, medan beta DM stör labila protein-protein interaktioner mellan komplexen. Underenheten sammansättning av protein komplex av beta-DM och digitonin-solubilized thylakoids presenteras här. Underenheterna för varje komplex hittas från den lodräta linjen nedanför det justerade komplexet.I princip representerar varje plats i 2-D-gelen ett individuellt protein. Men i praktiken kan flera proteiner av samma molekylära massa finnas på en enda plats. Identifieringen av fläckarna är baserad på masspektrometrianalys.Efter att ha tillämpat detta förfarande kan man fortsätta med andra metoder som elektronmikroskopi och enstaka partikelanalys av proteinkomplexen eluerade från den blå infödda gelen för att få strukturella insikter i proteinkomplexen. Att identifiera okända proteinunderenheter de enskilda proteinfläckarna från tvådimensionell SDS PAGE kan analyseras med massspec. Glöm inte att arbeta med akrylamid och digitonin kan vara extremt skadliga och försiktighetsåtgärder såsom bär skyddshandskar bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Karakterisering av Multi-subenhet proteinkomplex av Human MxA användning av icke-denaturerande polyakrylamidgel-elektrofores

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA-agarosgel-retardationsanalyser för analys av<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -treonylkarbamoyladenosin-TcdA-funktionen

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysera superkomplex av den mitokondriella elektrontransportkedjan med naturliga elektrofores, in-gel-analyser och elektrolys

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontell gelelektrofores för förbättrad detektion av protein-RNA-komplex

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-polymeras aktivitet Assay använder infrarött fluorescerande märkt DNA visualiseras med akrylamid gelelektrofores

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomiska analys av sammanhangsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analys av AtHIRD11 inneboende sjukdom och bindande mot metalljoner genom kapillär gelelektrofores och affinitet kapillärelektrofores

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...