Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Bu araştırma mali biyokütle (SE2B) Marie Skłodowska-Curie hibe sözleşmesine (675006) Finlandiya Akademisi (proje numaraları 307335 ve 303757) ve güneş enerjisi tarafından desteklenmiştir. İletişim kuralı başvuru3dayalı.

1. hazırlanması BN jel1,2,3
<ol><li>Jel tekeri plakalı 8 cm x 10 cm (dikdörtgen cam ve çentikli alümina plaka) 0,75 mm mesafe tutucular kullanarak üretici yönergelerine göre ayarlayın.</li>
	<li>Bir degrade karıştırıcı bir heyecan tabağa yerleştirin ve bir tüp tarafından peristaltik pompa ile bağlayın. Bir şırınga iğnesi tüp diğer ucunu takın ve cam ve alüminyum pl...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

Fotosentetik enerji dönüşüm makine thylakoid membran gömülü büyük multisubunit protein kompleksleri oluşur. Bu iletişim kuralı için çözümleme-in bitki thylakoid protein kompleksleri Arabidopsis thaliana BN sayfalı 2D-SDS-sayfa ile kombine ile gelen temel yöntemi açıklanır. Protokolü de thylakoid protein kompleksleri gelen tütün ve ıspanak thylakoids çözümlenmesi için uygundur, ama ufak değişiklikler gerektirebilir.
Membran protein kompleksleri solubiliza...

Büyük multisubunit protein kompleksleri photosystem PSI ve PSII, Cyt b6f ve ATPaz koordine NADPH ve ATP üretimi fotosentetik ışık reaksiyonlarda. Daha yüksek bitki kloroplast içinde kompleksleri appressed grana ve appressed stroma thylakoids oluşan bir yapısal olarak heterojen membran yapıdır thylakoid zarının içinde yer alır. Mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) büyük multisubunit protein kompleksleri onların yerli ve biyolojik olarak aktif biçimde analizinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Yöntem mitokondrial membran protein kompleksleri1diseksiyon için kuruldu, ancak sonra thylakoid membran ağ3protein kompleksleri ayrılması için özelleştirilmiş. Yöntem (i) tek tek thylakoid protein kompleksleri için yapısal analizi, (ii) yerli protein kompleksleri Hofstede belirlemek için ve (iii) protein kompleksleri genel organizasyonu analizi için arıtma için uygundur çevre ipuçları değiştirme üzerine.
Ayrılık öncesinde protein kompleksleri genellikle hafiftir ve protein kompleksleri doğal yapısını korumak dikkatle seçilmiş Nonyonik deterjanlar ile membran etkilenmezsiniz. Deterjanlar içeren hidrofobik ve hidrofilik siteleri ve form istikrarlı micelles bir belirli konsantrasyon, yukarıda adı verilen bir kritik micellar konsantrasyonu (CMC). CMC sonuçlarının lipid-lipid etkileşimleri bozulma ve protein kompleksleri solubilization üzerinde deterjan konsantrasyonu artan. Deterjan seçimi protein kompleksi ilgi kararlılığını ve deterjan solubilization kapasitesine bağlıdır. Rutin olarak kullanılan deterjanlar α/β-Lauryl-maltoside ve digitonin içerir. Protein kompleksleri içinde onların yerli durum solubilization çözünmez malzeme Santrifüjü tarafından kaldırılır. Yüksek bitkilerde thylakoid membran yapısı içinde son derece heterogenic ve bazı deterjanlar (Örneğin, digitonin), seçmeli olarak membran3yalnızca belirli bir kısmını solubilize. Bu nedenle, protein kompleksi kuruluş ya da protein kompleksleri arasındaki etkileşimler ayırdetmek için bu her zaman klorofil içeriği ve klorofil a/b belirleyerek seçilen deterjan solubilization kapasitesini belirlemek önemlidir verim ve temsil thylakoid (sub) etki alanı, sırasıyla, solubilized kısmını değerlendirmeye süpernatant sayısına oranı. Büyüme-ışık iklime alıştırılacağı bitkilerin sağlam thylakoids klorofil a/b oranı genellikle yaklaşık 3, ise chl bir / b değeri thylakoid kesirler zenginleştirilmiş grana birinde veya stroma thylakoids düşer (~ 2.5 altında) veya (~ 4.5) toplam değerini aşıyor thylakoids, anılan sıraya göre.
Protein kompleksleri için negatif yük sağlamak için Coomassie parlak mavi (CBB) boya solubilized örneğe eklenir. Şarj kayması nedeniyle protein kompleksleri anot doğru göç ve molekül ağırlığı ve şekil göre bir Akrilamid (AA) degrade olarak ayrılır. Etkili ve yüksek çözünürlüklü ayırma doğrusal akrilamid konsantrasyon gradyanı kullanılarak elde edilir. Onlar kendi boyut bağımlı gözenek boyutu sınırına ulaşıncaya kadar Elektroforez sırasında protein kompleksleri anot doğru göç. (İ toplam akrilamid polyacrylamide jel gözenek büyüklüğüne bağlıdır /bis- akrilamid konsantrasyonu (T) ve (II) cross-linker bis- akrilamid monomer konsantrasyonu (C) göre toplam monomerleri4. BN-sayfa ile boşanmadan sonra protein kompleksleri daha fazla onların bireysel protein alt ikinci boyut (2D) - SDS - sayfa tarafından alt. Burada, thylakoid membran protein kompleksleri BN-/ 2D SDS-sayfa tarafından çözümlenmesi için detaylı bir protokol açıklayın.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

Fotosentetik Elektron transferi zinciri (vb) NADPH ve ATP şeklinde kimyasal enerji güneş enerjisi dönüştürür. Dört büyük protein kompleksleri elektron sudan NADP+ ile iki photosystems için sürücü ve ATP üretimi için oluşturulan proton degrade kullanmak için thylakoid membran hasat güneş enerjisi gömülü. Photosystem PSII, psişik, sitokrom b6f (Cyt b6f) ve ATPaz farklı yönlendirme ve thylakoid membran dinamikleri ile tüm multiprotein kompleksleri vardır. Kompozisyon ve thylakoid membran protein kompleksleri etkileşimleri hakkında değerli bilgiler elde hafif deterjan yerli jel elektroforetik ayrımı tarafından takip tarafından kompleksleri membran bütünlüğü gelen çözücü tarafından kompleksleri. Mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) protein kompleksleri yerli ve fonksiyonel formlarındaki ayrılması için kullanılan bir analitik yöntemdir. Yöntem protein kompleksi arıtma daha ayrıntılı yapısal analizi için kullanılabilir, ama aynı zamanda protein kompleksleri arasındaki dinamik etkileşimler incelemek için bir araç sağlar. Yöntem mitokondrial solunum protein kompleksleri, analiz için geliştirilmiştir ama beri en iyi duruma getirilmiş ve thylakoid protein kompleksleri diseksiyon için geliştirilmiş. Burada, biz değişken fotosentetik protein kompleksleri ve onların etkileşimlerde Arabidopsis thalianaanalizi için detaylı güncel iletişim kuralı sağlar.

Şekil 1 ' deki temsilcisi bir 2D-BN/SDS-sayfa sistemi digitonin ve β-DM-çözündürüldükten thylakoid protein kompleksleri ayrılması ve kendi detaylı protein alt birimi kompozisyon göstermektedir. Çözündürüldükten digitonin thylakoids ( Şekil 1Aüst üstte Yatay jel) protein karmaşık desen içerir PSII-LHCII-PSI megacomplex, iki büyük PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomer (m), PSI...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Bir iletişim kuralı bitki aydınlatma için thylakoid protein kompleksi organizasyon ve mavi yerel polyacrylamide ile kompozisyon jel elektroforez (BN-sayfa) ve 2D-SDS-sayfa açıklanmıştır. Protokol Arabidopsis thalianaiçin optimize edilmiş ama küçük değişiklikler ile diğer bitki türleri için kullanılabilir.

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Bu yöntem, bitki thylakoid membranındaki fotosentetik protein komplekslerinin bileşimi ve dinamik organizasyonu ile ilgili anahtar soruların cevaplandırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, yerli protein kompleksleri arasındaki fonksiyonel etkileşimlerin analizine olanak sağlaması ve değişen çevre koşullarında protein kompleksi organizasyonunun plastisitesini aydınlatan olmasıdır. 0,75 milimetrelik spacers kullanarak üreticinin talimatlarına göre 10 santimetre plakalar ile jel caster sekiz santimetre ayarlayın.Bir karıştırma plakası üzerine bir degrade karıştırıcı yerleştirin ve boru ile peristaltik pompa ile bağlayın. Borunun diğer ucuna bir şırınga iğnesi takın ve iğneyi cam ile alüminyum plaka arasına yerleştirin. Ağır hazneye manyetik bir karıştırıcı yerleştirin.Ayırma jeli gradyanı için kullanmak üzere metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi 15 mililitrelik konik santrifüj tüplerde %3,5 ve %12,5 akrilamid çözeltileri hazırlayın. Zamansız polimerizasyonu önlemek için çözeltileri hazırlarken santrifüj tüplerini buzda tutun. Degrade mikseriçin çözümler pipepetting hemen önce% 5 APS ve TEMED ekleyin.Pipet ağır hazneye %12,5 çözüm sağlar. Çözeltinin ışık odasına girmesine izin veren iki odayı birbirine bağlayan vanayı açarak, Hafif ve ağır odayı birbirine bağlayan kanaldaki hava kabarcıklarını çıkarın. Vanayı ve pipeti çözeltinin izlerini ağır hazneye kapatın.Son olarak, pipet ışık odasına% 3.5 çözüm. Manyetik karıştırıcıyı aç. Vanaları açın ve peristaltik pompayı açın.Jel çözeltilerinin cam ve alüminyum plaka arasında dakikada yaklaşık 0,5 mililitre akış hızında akmasına izin verin. İğne her zaman sıvının üzerinde olmalıdır. Ağır ve hafif odalar boşaltıldığında onları ultra saf suyla doldurun.Ve su yavaşça jel yüzeyi kaplamak için izin verin. Jel polimerizasyonu oda sıcaklığında yaklaşık bir ila iki saat sürer. Oda sıcaklığında istifleme jeliçin% 3 akrilamid çözeltisi hazırlayın.Pipet polimerize ayırma jel üstüne istifleme jel ve hava kabarcıkları kaçınarak cam ve alüminyum plaka arasında bir örnek jel tarak yerleştirin. Jelin oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika polimerleşmesine izin vererek, taramayı ultra saf su altında hafifçe çıkarın. Bu noktada jel birkaç gün nemli koşullarda pozitif dört derece santigrat saklanabilir.Mililitre başına bir miligram son klorofil konsantrasyonu için buz gibi 25BTH20G tampon ile seyreltilmiş izole thylakoids. Her thylakoid örnek için iki tüp hazırlayın hem beta-DM hem de digitonin solubilizasyonunu gerçekleştirin. Şimdi deterjan tampon eşit hacimli ekleyin.Deterjan ve thylakoid örneğini bir pipetle hafifçe karıştırın ve hava kabarcıkları yapmaktan kaçının. Beta-DM solubilizasyon için buz üzerinde iki dakika için thylakoids solubilize. Veya oda sıcaklığında 10 dakika bir rocker veya shaker üzerinde sürekli nazik karıştırma ile digitonin solubilizasyon için.Kuluçkadan sonra, 18, 000 g pozitif dört derece santigrat 20 dakika santrifüj ile insolubilized malzeme çıkarın. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve numuneye 1/10 hacimli Coomassie parlak mavi tampon ekleyin. Jeli dikey bir elektroforez sistemine ayarlayın.Üst tampon odasını mavi katot arabelleğiyle doldurun ve alt arabellek odasına anod arabelleği dökün. Thylakoid örneklerini kuyulara yükleyin. Elektroforezi başlatın ve metin protokolünde listelenen voltajı kademeli olarak artırın.Jeli soğuk bir oda kullanarak veya jel sıcaklığını soğutma sistemiyle ayarlayarak pozitif dört derecede çalıştırın. Örnek ön jel yaklaşık 1/3 göç ettiğinde açık bir katot tampon mavi katot arabelleği değiştirin. Elektroforetik çalışmadan sonra görüntü arşivleme için bir fotoğraf tarayıcı ile jel tarayın.2-SDS PAGE gerçekleştirmek için bir milimetrelik spacers kullanarak dikey elektroforez sistemi monte. Metin protokolünde açıklandığı gibi 2-B tarak ile standart bir SDS jel hazırlayın. BN jel şerit kes ve beş mililitrelik bir tüp yerleştirin.Sonra Laemmli tampon iki mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında hafif sallayarak 45 dakika boyunca şerit kuluçka. Hava kabarcıkları kaçınarak jel üstüne bir spacer yardımı ile şerit yerleştirin. Pipet filtre kağıt dar bir parça üzerinde moleküler ağırlık marker beş mikrolitre ve standart kuyukağıt yerleştirin.BN jel şerit mühür ve marker kağıt jel şerit üstüne çalışan tampon% 0.5 agarose dökün ve katılaşmak için izin. Standart protokollere göre elektroforez gerçekleştirin. Elektroforetik çalışmadan sonra proteinleri SUPRO Yakut lekesi veya gümüş lekesi ile görselleştirin.Beta-DM'nin thylakoid protein kompleks desenleri ve digitonin-çözünürörneklerinin temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Küçük kompleksler elektroforetik çalışma sırasında daha hızlı göç ve jel alt kısmında bu nedenle. Büyük kompleksleri jel üst kısmında ise.Beta DM kompleksleri arasındaki labile protein-protein etkileşimleri ile müdahale ederken Digitonin genellikle büyük derlemelerde protein kompleksleri korur. Beta-DM ve digitonin-solubilize thylakoidlerin protein komplekslerinin alt birim bileşimi burada sunulmuştur. Her kompleksin alt birimleri hizalanmış kompleksin altındaki dikey çizgiden bulunur.Prensip olarak, 2-B jel her nokta bireysel bir protein temsil eder. Ama pratikte, aynı moleküler kütleye ait birkaç protein tek bir noktada bulunabilir. Lekelerin tanımlanması kütle spektrometresi analizine dayanır.Bu prosedürü uyguladıktan sonra, protein kompleksleri hakkında yapısal kavrayışlar elde etmek için mavi yerli jelden gelen protein komplekslerinin elektron mikroskobu ve tek parçacık analizi gibi diğer yöntemlerle devam edilebilir. Bilinmeyen protein alt birimlerini belirlemek için iki boyutlu SDS PAGE'deki tek tek protein noktaları kütle spektrometresi ile analiz edilebilir. Akrilamid ve digitonin ile çalışmanın son derece zararlı olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken koruyucu eldiven takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...