Name: phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding for single cell signaling analysis and biomarker discovery
Uploaded: 2018-10-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery at JoVE.com

Detta arbete genomfördes i labbet av Professor Kjetil Taskén, och stöddes av de norska Cancerföreningen och Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron och Marianne Enger erkänns för kritisk läsning av manuskriptet.

Blodprov togs emot efter skriftligt samtycke från alla givare. Studien godkändes av den regionala kommittén för medicin och hälsa forskning etik i sydöstra Norge och forskning om humant blod genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen8.
Obs: Steg 1-3 bör utföras under sterila förhållanden i vävnadsodling huva.
1. isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från KLL patientens blodprov
<p class...

<ol>
	<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+reverse-phase+protein+arrays+as+pharmacodynamic+assays+for+functional+proteomics,+biomarker+discovery,+and+drug+development+in+cancer.">Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer.</a> Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling.">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).</li><li>Myhrvold, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+profiling+of+phospho-protein+levels+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia.</a> Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).</li><li>Parente-Ribes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spleen+tyrosine+kinase+inhibitors+reduce+CD40L-induced+proliferation+of+chronic+lymphocytic+leukemia+cells+but+not+normal+B+cells.">Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells.</a> Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).</li><li>Blix, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospho-specific+flow+cytometry+identifies+aberrant+signaling+in+indolent+B-cell+lymphoma.">Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma.</a> BMC Cancer. 12, 478 (2012).</li><li>Irish, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+profiling+of+potentiated+phospho-protein+networks+in+cancer+cells.">Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells.</a> Cell. 118 (2), 217-228 (2004).</li><li>Myklebust, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+B-cell+receptor+signaling+in+non-Hodgkin+lymphomas+identified+by+single-cell+profiling.">Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling.</a> Blood. 129 (6), 759-770 (2017).</li><li>World Medical Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Medical+Association+Declaration+of+Helsinki:+ethical+principles+for+medical+research+involving+human+subjects.">World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects.</a> THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).</li><li>Siveen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+STAT3+signaling+pathway+in+cancer:+role+of+synthetic+and+natural+inhibitors.">Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).</li><li>Fabbri, G., Dalla-Favera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+pathogenesis+of+chronic+lymphocytic+leukaemia.">The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).</li><li>Arnason, J. E., Brown, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+B+Cell+Signaling+in+Chronic+Lymphocytic+Leukemia.">Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia.</a> Current Oncology Reports. 19 (9), 61 (2017).</li><li>Landskron, J., Tasken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoprotein+Detection+by+High-Throughput+Flow+Cytometry.">Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).</li><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry.">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li><li>Pollheimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-33+drives+a+proinflammatory+endothelial+activation+that+selectively+targets+nonquiescent+cells.">Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).</li><li>Erts&#229;s, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsphere+cytometry+to+interrogate+microenvironment-dependent+cell+signaling.">Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling.</a> Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).</li><li>Lin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+phospho-specific+flow+cytometry+can+detect+dynamic+changes+of+phospho-Stat1+level+in+lung+cancer+cells.">Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells.</a> Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).</li><li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry-based+single-cell+analysis+of+intact+epithelial+signaling+reveals+MAPK+activation+divergent+from+TNF-alpha-induced+apoptosis+in+vivo.">Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo.</a> Molecular Systems Biology. 11 (10), 835 (2015).</li><li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+coordination+between+signaling+pathways+is+revealed+in+human+colorectal+cancer+using+single-cell+mass+cytometry+of+archival+tissue+blocks.">Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks.</a> Science Signaling. 9 (449), rs11 (2016).</li><li>Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+medicine+for+cancer+with+next-generation+functional+diagnostics.">Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).</li></ol>

Phospho flödescytometri är en kraftfull teknik för att mäta fosforylering proteinnivåer i enstaka celler. Eftersom metoden bygger på färgning med antikroppar, begränsas phospho flödescytometri av antikropp tillgänglighet. Dessutom för att få tillförlitliga resultat, bör alla antikroppar titreras och verifieras före användning. Ett detaljerat protokoll för titrering av phospho-specifika antikroppar har varit beskrivs på annan plats12. Under panel design är övervägande av signal...

Phospho flödescytometri används för att analysera fosforylering proteinnivåer på encelliga upplösning. Det övergripande målet med metoden är att kartlägga cellulär signalering mönster under angivna förhållanden. Genom att utnyttja flödescytometri multiparametrar kapacitet, kan flera signalvägar analyseras samtidigt i olika undergrupper av en heterogen cell befolkningen såsom perifert blod. Dessa egenskaper ger fördelar över andra antikroppsbaserade tekniker såsom immunohistokemi, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), protein array och omvänd fas protein array (RPPA)1. Phospho flödescytometri kan kombineras med fluorescerande cell streckkodning (FCB), vilket innebär att enskild cellprover är märkta med unika signaturer av fluorescerande färger så att de kan blandas ihop, målat och analyseras som ett enda prov2. Detta reducerar antikropp förbrukningen, ökar data robustheten genom kombinationen av kontroll och behandlade prover, och ökar hastigheten på förvärvet. Kombinerade FCB befolkningen kan sedan vara uppdelad i mindre prover och färgade med upp till 35 distinkta phospho-specifika antikroppar, beroende på mängden utgångsmaterial. Stor profilering experiment kan, därmed, köras med standard cytometer hårdvara. Phospho flödescytometri har tillämpats på profil signalering utbildningsavsnitt i patientprover från flera hematologiska cancerformer inklusive kronisk lymfatisk leukemi (KLL)3,4,5, akut myeloisk leukemi (AML) 6 och non-Hodgkin lymfom7. Phospho flödescytometri är således en kraftfull metod att karakterisera signalering avvikelser, identifiera och validera biomarkörer och bedöma farmakodynamik.
Här, tillhandahålls optimerad protokollet för analys av KLL patientprover av phospho flödescytometri (figur 1A). Exempel på basal signalering karakterisering, anti-IgM/B cell receptorn stimulering och drog störning visas. En detaljerad beskrivning av en FCB matris tillhandahålls. Protokollet kan enkelt anpassas till andra suspension celltyper.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10270169</td>
			<td>Additive to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360-039</td>
			<td>Additive to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140-035</td>
			<td>Additive to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS</td>
			<td>1114547</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-IgM</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>2022-01</td>
			<td>For stimulation of the B cell receptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Phosflow Fix Buffer I</td>
			<td>BD</td>
			<td>557870</td>
			<td>Fixation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Phosflow Perm Buffer III</td>
			<td>BD</td>
			<td>558050</td>
			<td>Permeabilization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 5-TFP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A30005</td>
			<td>Barcoding reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Succinimidyl Ester</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P10163</td>
			<td>Barcoding reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P30253</td>
			<td>Barcoding reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation beads</td>
			<td>Defined by user</td>
			<td></td>
			<td>Correct species reactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Defined by user</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Defined by user</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plates</td>
			<td>Defined by user</td>
			<td></td>
			<td>Compatible with the flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuges</td>
			<td>Defined by user</td>
			<td></td>
			<td>For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Defined by user</td>
			<td></td>
			<td>Temperature regulated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Defined by user</td>
			<td></td>
			<td>With High Throughput Sampler (HTS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT (pS473)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4075</td>
			<td>Clone: D9E 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&#8230;, Haematologica, 101(2):e59-62 
			Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410 
			Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&#8230;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATF-2 (pT71)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8398</td>
			<td>Clone: F-1 
			Reference: Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410 
			Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&#8230;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLNK (pY84)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558443</td>
			<td>Clone: J117-1278 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&#8230;, Haematologica, 101(2):e59-62 
			Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&#8230;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 
			Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&#8230;, Blood, 129(6): 759-770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Btk (pY223)/Itk (pY180)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>564846</td>
			<td>Clone: N35-86 
			Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&#8230;, Blood, 129(6): 759-770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Btk (pY551)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558129</td>
			<td>Clone: 24a/BTK (Y551)&#160; 
			Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&#8230;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Btk (pY551)/Itk (pY511)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558134</td>
			<td>Clone: 24a/BTK (Y551)&#160; 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&#8230;, Haematologica, 101(2):e59-62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3&#950; (pY142)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558489</td>
			<td>Clone: K25-407.69 
			Reference: Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone H3 (pS10)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9716</td>
			<td>Clone: D2C8 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I&#954;B&#945;</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>5743</td>
			<td>Clone: L35A5 
			Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&#8230;, Blood, 129(6): 759-770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAT (pY171)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558518</td>
			<td>Clone: I58-1169 
			Reference: Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lck (pY505)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558577</td>
			<td>Clone: 4/LCK-Y505&#160; 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEK1 (pS298)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>560043</td>
			<td>Clone: J114-64 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-&#954;B p65 (pS529)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558422</td>
			<td>Clone: K10-895.12.50 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410 
			Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&#8230;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 
			Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&#8230;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NF-&#954;B p65 (pS536)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4887</td>
			<td>Clone: 93H1 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410 
			Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&#8230;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK (pT180/Y182)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4552</td>
			<td>Clone: 28B10 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410 
			Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&#8230;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (pT202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4375</td>
			<td>Clone: E10 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&#8230;, Haematologica, 101(2):e59-62 
			Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410 
			Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&#8230;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 
			Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&#8230;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 (pS15)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>NN</td>
			<td>Clone: 16G8 
			Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&#8230;, Blood, 109(6):2589-96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 (pS20)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>NN</td>
			<td>Clone: Polyclonal 
			Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&#8230;, Blood, 109(6):2589-96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 (pS37)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>NN</td>
			<td>Clone: Polyclonal 
			Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&#8230;, Blood, 109(6):2589-96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 (pS46)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>NN</td>
			<td>Clone: Polyclonal 
			Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&#8230;, Blood, 109(6):2589-96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 (pS392)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>NN</td>
			<td>Clone: Polyclonal 
			Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression&#8230;, Blood, 109(6):2589-96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLC&#947;2 (pY759)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558498</td>
			<td>Clone: K86-689.37 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&#8230;, Blood, 129(6): 759-770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb (pS807/pS811)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558590</td>
			<td>Clone: J112-906 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&#8230;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-Ribos. Prot. (pS235/236)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4851</td>
			<td>Clone: D57.2.2E 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAPK/JNK (pT183/Y185)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9257</td>
			<td>Clone: G9 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial&#8230;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLP76 (pY128)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>558438</td>
			<td>Clone: J141-668.36.58&#160; 
			Reference: Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAT1 (pY701)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>612597</td>
			<td>Clone: 4a&#160; 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&#8230;, Blood, 129(6): 759-770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAT3 (pY705)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>557815</td>
			<td>Clone: 4/P-STAT3 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAT4 (pY693)</td>
			<td>Zymed/ThermoFisher Scientific</td>
			<td>71-7900</td>
			<td>Clone: Polyclonal 
			Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAT5 (pY694)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>612599</td>
			<td>Clone: 47/Stat5(pY694) 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410 
			Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&#8230;, Blood, 129(6): 759-770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAT6 (pY641)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>612601</td>
			<td>Clone: 18/P-Stat6 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYK (pY525/Y526)</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>12081</td>
			<td>Clone: C87C1 
			Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 
			Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&#8230;, Haematologica, 101(2):e59-62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZAP70/SYK (pY319/Y352)</td>
			<td>Beckton Dickinson Pharmingen</td>
			<td>557817</td>
			<td>Clone: 17A/P-ZAP70 
			Reference: Sk&#229;nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28&#8230;, Biochem J, 460(3):399-410 
			Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed&#8230;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 
			Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in&#8230;, Blood, 129(6): 759-770</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding for single cell signaling analysis and biomarker discovery

Avvikande cellsignalering spelar en central roll i utvecklingen av cancer och progression. Mest roman riktade terapier riktar verkligen proteiner och protein funktioner och cell signalering avvikelser kan därför tjäna som biomarkörer för att ange anpassade behandlingsalternativ. I motsats till DNA och RNA analyser, kan förändringar i proteinaktiviteten mer effektivt utvärdera mekanismerna bakom drogen känslighet och resistens. Phospho flödescytometri är en kraftfull teknik som mäter protein fosforylering händelser på cellulär nivå, en viktig funktion som skiljer metoden från andra antikroppsbaserade metoder. Metoden som möjliggör samtidig analys av flera signalering proteiner. I kombination med fluorescerande cell barcoding, kan större medel - till hög genomströmning-datamängder förvärvas genom standard cytometer maskinvara på kort tid. Phospho flödescytometri har tillämpningar både i studier av grundläggande biologi och i klinisk forskning, inklusive signalering analys, biomarkör identifiering och bedömning av farmakodynamik. Här ges en detaljerad experimentellt protokoll för phospho Flödesanalys av renat perifera mononukleära blodceller, med kronisk lymfatisk leukemiceller som exempel.

De viktigaste stegen i protokollet phospho flöde flödescytometri illustreras i figur 1A. I presenteras exempel var KLL celler fläckad med streckkodning reagensen Pacific Blue på fyra utspädningar. Tredimensionella streckkodning kan utföras genom att kombinera tre streckkodning färgämnen, som illustreras i figur 1B. De enskilda proverna är sedan deconvoluted av efterföljande gating på varje streckkodning reagens kon...

Watch this Scientific Journal Video about Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery at JoVE.com

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Här presenteras ett protokoll för medel - till hög genomströmning analys av protein fosforylering händelser på cellnivå. Phospho flödescytometri är en kraftfull metod att karakterisera signalering avvikelser, identifiera och validera biomarkörer och bedöma farmakodynamik.

Phospho flödescytometri med fluorescerande Cell streckkodning för enstaka Cell signalering analys och biomarkör identifiering

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom områdena cellbiologi och immunologi såsom hur är signalering vägar påverkas av olika stimuli eller droger? Den största fördelen med denna teknik är att det låter dig utföra encellssignaleringsanalys i medium till hög genomströmning mode. Efter åter avbryta cellerna i kompletterade RPMI 16/40 medium, överföra den erforderliga mängden cell suspension till brunnarna i en 96 väl V-bottenplatta.Överför plattan till en förvärmd 37 grader Celsius vattenbad och låt den vila där i 10 minuter. Tillsätt sedan 60 mikroliter av fast buffert en till varje brunn av en ny 96 väl platta för att ställa in fix plattan. Placera denna platta i 37 grader Celsius vattenbad.Överför ett 50 mikroliterkontrollprov till plattan och blanda genom pipettering upp och ner. Tillval, tillsätt 10 mikroliter per milliliter anti-IgM till cellerna för att starta simuleringstidskursen och blanda genom pipettering upp och ner. Överför ett 50 mikroliterprov till fixplattan vid varje tidpunkt, blanda varje prov när det tillsätts.Efter det att det sista provet har tillsatts, låt fixplattan vara kvar i vattenbadet i 10 minuter. Först tvätta cellerna tre gånger med PBS. Centrifugera plattan vid 500 gånger G i fem minuter och kassera supernatanten.Därefter förbereda en färsk 96 väl V-bottenplatta med barcoding reagenser, genom pipettering fem mikroliter av varje barcoding reagens i varje brunn fylla antalet brunnar som krävs för att fläcka var och en av proverna. I den fasta cellplattan, resuspend cellerna i varje brunn med 190 mikroliter av PBS. Sedan överför varje brunn av celler till motsvarande brunn i stångplåten, blanda varje väl noggrant.Låt plattan vila i rumstemperatur i 20 minuter i mörker. Centrifugera plattan vid 500 gånger G i fem minuter och kassera supernatanten. Efter detta tvättar du cellerna i varje brunn två gånger med flödestvätten.Tillsätt sedan 190 mikroliter av flödestvätt till varje brunn av celler. Kombinera alla streckkodade prover i ett 15 milliliterrör och överför varje kompensationskontroll till ett separat 1,7 milliliterrör. Centrifugera vid 500 gånger G i fem minuter och kassera supernatanten.Till att börja, överför två milliliter perm buffert tre till en 15 milliliter rör. Förvara på minus 20 grader Celsius så det blir iskallt när det används. När du är klar, tillsätt 1,5 milliliter iskall perm buffert till 15 milliliter röret som innehåller streckkodade cellpopulationen droppvis medan virvelning för att undvika cellklumpning.Lägg till 100 mikroliter iskall perm buffert till var och en av kompensationskontrollerna på samma sätt. Omedelbart överföra cellerna till en frys på minus 80 grader Celsius i minst 30 minuter. När du är redo att påbörja antigenfärgning, ta bort cellerna från frysen och överför dem till en låda med is.Tvätta cellerna tre gånger med ett överskott av flödestvätt. Centrifugera cellerna vid 500 gånger G och fyra grader Celsius i fem minuter. Kassera supernatanten och åter upphäva streckkodade cellpopulationen i en volym av flödestvätt, sådan är att det finns 25 mikroliter av cell suspension per fosfo-antikropp fläck.Åter avbryta kompensationskontrollerna i 200 mikroliter av flödestvätt. För att börja förbereda antikroppar för färgning, tillsätt 10 mikroliter av fosfo-specifik antikropp, utspädd i flödestvätt, till varje brunn av en färsk 96 väl V-bottenplatta. Tillsätt 15 mikroliter av ytmarkör, utspädda i flödestvätt och 25 mikroliter cellfjädring till varje brunn för en slutvolym på 50 mikroliter per brunn.Låt cellerna vila i 30 minuter i rumstemperatur i mörkret. Efter detta tvättar du de färgade cellerna två gånger med flödestvätt. Centrifugera vid 500 gånger G i fem minuter.Kassera supernatanten och dra upp cellerna på 150 mikroliter flödestvätt. Utför sedan flödescytometrianalys som det skisseras i textprotokollet. I det presenterade protokollet utförs tredimensionell barkodning genom att kombinera tre barcoding färgämnen.Enskilda prover de-invecklats sedan genom efterföljande gating på varje barcoding reagens kontra sidan scatter område. De basala och stimuleringsinducerade fosforyleringsnivåerna av 20 signalmolekyler nedströms av B-cellsreceptorn kännetecknas sedan i B-celler från KLL-patienter och normala kontroller under olika förhållanden. Stat3-fosfotyrosin 705 ses vara betydligt upp reglerad.Celler stimuleras med anti-IgM i upp till 30 minuter för att identifiera signalering av avvikelser induceras genom B-cellen receptorn vägen. Medan KLL-celler från patienter med unmutated IGVH display ökad känslighet mot anti-IgM stimulering, det är endast statistiskt signifikant för AKT fosfor serin 473. Celler utsätts sedan för PI 3-kinasdel inhibitor idelalisib för att testa om den avvikande AKT pS473 signalen kan vändas.Som framgår här, de avvikande nivåerna minskas avsevärt vid behandling i en koncentration beroende sätt som visar att kinashämmare kan tillämpas för att normalisera avvikande signalering i KLL-celler. Innan du försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att titera barcoding reagenser och antikroppar, och att kontrollera att utvalda ytmarkörer är kompatibla med fixering och permeabilisering reagenser. Cellerna måste vara i suspension för fosfor analys, fortfarande protokollet kan anpassas till avvikande celler eller vävnad efter förfaranden för att få encells suspension, såsom hela trypzination.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Cancer Research

Unit 1

Principles of Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakterisera sjukdomsrelaterade mutanter av RAF-Familjekinaser genom att använda en uppsättning praktiska och genomförbara metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell cykelns specifika mätningar av γH2AX och apoptos efter genotoxisk stress genom flödescytometri

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Utforska argininmetylomet genom kärnmagnetisk resonansspektroskopi

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Samtidig avbildning och flödescytometribaserad detektion av flera fluorescerande åldrande markörer i terapiinducerade senescenta cancerceller

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Långt-röd fluorescerande åldrande-associerad β-galaktosidassond för identifiering och anrikning av åldrande tumörceller genom flödescytometri

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

En flödescytometribaserad cellytproteinbindningsanalys för bedömning av selektivitet och specificitet hos en anticanceraptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexerad streckkodande bildanalys för immunprofilering och karakterisering av rumslig kartläggning vid encellsanalys av paraffinvävnadsprover

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...