Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van blast schadelijke traumatisch hersenletsel en kan worden gebruikt om neuroprotectieve drugs scherm voor het gebruik van meer complexe in Vivo modellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik maakt van een laboratoriuminstrument om in Vitro massa hersenweefsel bloot te stellen aan een schokgolf met behulp van een eenvoudige en hoge doorvoer protocol dat het mogelijk maakt het creëren van een reproduceerbare schade. Steek eerst steriele op maat gemaakte roestvrijstalen ringen in de putten van een zesputplaat.
Voeg vervolgens voorverwarmd serumvrij experimenteel medium met propidiumjodide toe aan de putten, zodat het niveau van medium niet boven de inkeping van de ring komt. Breng de plaat een uur naar de couveuse om ervoor te zorgen dat het medium op 37 graden Celsius staat voordat de weefselkweekinserts worden overgedragen. Na een uur, overdracht weefsel cultuur inserts met organotypische plakjes van hun groei gerechten op de ringen in de zes put plaat.
Maak een stip op de insert velg in de drie uur positie met een permanente marker pen te vergemakkelijken terug te keren van de inserts naar zijn oorspronkelijke positie, dan label elke zes goed plaat met een unieke naam en datum en maak een kaart van de putten van elke plaat, naamgeving elk goed met een letter en elk plakje in de put met een nummer, zodat elk segment heeft een unieke identificatie. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur om ervoor te zorgen dat de plakjes zijn op 37 graden Celsius vlak voor beeldvorming. Een uur na de overdracht naar experimenteel medium, beoordelen slice gezondheid door snel imaging elk segment individueel en sequentieel onder laag vermogen.
Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een geschikte excitatie en emissiefilter idealiter in een donkere kamer of een kamer met weinig licht. Houd het deksel op de plaat bij het beeldvorming. Aan de binnenkant van het deksel kan condensatie ontstaan.
Als dit gebeurt, kort gebruik maken van een haardroder op de lage instelling aan de buitenkant van het deksel. Zorg ervoor dat de beeldomstandigheden identiek zijn op verschillende dagen en tussen experimenten. Bij baseline, gezonde plakjes tonen zeer weinig fluorescerende vlekken.
Plakjes die gebieden met dichte rode vlekken vertonen, geven gecompromitteerde levensvatbaarheid aan en moeten worden uitgesloten van verdere analyse. Ter vergelijking, fluorescentie van de explosie gewonde slice op 72 uur wordt hier weergegeven. Onmiddellijk na beeldvorming, verwijder een weefsel cultuur insert uit de zes put plaat en zorgvuldig de overdracht van de insert naar een steriele polyethyleen zak met 20 milliliter van voorverwarmde experimentele medium bubbelde met 95%zuurstof en 5% kooldioxide.
Verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen en verzegel de steriele zak door de bovenkant te draaien en een plastic klem aan te brengen. Zorg ervoor dat elke steriele zak correct is gelabeld met de plaat en goed identificatie. Na het overbrengen van elke weefselkweek invoegen op een individuele steriele zak, plaats de zakken en de zes put platen met experimenteel medium in de 37 graden Celsius incubator.
Na een uur, zorgvuldig pak de steriele zakken met de weefselcultuur inserts in plastic dozen in een thermische gereguleerde doos gevuld met het geïoniseerde water op 37 graden Celsius. Het water moet de organotypische plakjes op fysiologische temperatuur houden gedurende het protocol voor blootstelling aan schokgolven. Draag stalen laarzen, een laboratoriumjas en handschoenen tijdens de voorbereiding van de schokbuis en de blootstelling aan schokgolven.
Gebruik een loslegstaaf om het steriele zakhouderframe vast te bouten aan de schokbuis distale flens die ervoor zorgt dat het centrale gat is uitgelijnd met de schokbuisuitlaat. Sensor één, een drukomvormer, bevindt zich in het middelste deel van de aangedreven sectie en sensor twee bevindt zich in de distale flens van de schokbuis. Sluit deze druktransducers aan op een oscilloscoop via een stroombron en zet de oscilloscoop aan.
Zorg ervoor dat de solenoïde klep en de stroomregeling van de schokbuis gesloten zijn, open vervolgens de externe persluchtlijn en laad de solenoïde klep op tot 2,5 bar. Open de persluchtcilinder veiligheidsklep en open langzaam de drukregelaar om de druk te verhogen tot ongeveer vijf bar. Bereid vervolgens diafragma's door 23 micron dikke polyester platen in 10 bij 10 centimeter vierkanten te snijden.
Bereid handvatten van autoclave tape en plak ze aan de boven-en onderkant van elk diafragma. Plaats een diafragma in de breuk en zorg ervoor dat ze gecentreerd zijn. Klem vervolgens het middenrif met vier M24 bouten en moeren.
Mode ze sequentieel in een diagonaal symmetrische manier, terwijl ervoor te zorgen dat de diafragma's zijn rimpel vrij. Klem een steriele zak in een verticale positie op het houderframe om ervoor te zorgen dat het oppervlak van de weefselkweek invoegen met de organotypic hippocampal plakjes is gericht op de schokbuis uitlaat en de weefselcultuur insert is gecentreerd in de steriele zak. Voor de dubbele diafragmaconfiguratie is de barstende druk afhankelijk van het gasdrukverschil tussen de bestuurder en de dubbele breukkamer.
Daarom wordt de dubbele inbreukveiligheidsklep handmatig geopend zodra de doeldruk is bereikt. Zet op oor verdedigers en veiligheidsbril als niet al versleten. Sluit de solenoïde klep.
Schakel de huidige bronkrachtcentrale in om de shockwavegegevens te verkrijgen. Manipuleer de stroomregelknop op het bedieningspaneel van de schokbuis om het bestuurdersvolumegedeelte van de schokbuis langzaam onder druk te zetten voor een enkele diafragmaconfiguratie of zowel de sectie van het bestuurdersvolume als het dubbele breukgedeelte van de schokbuis voor een dubbele diafragmaconfiguratie. Zodra het membraan scheurt, snel gesloten de persluchtstroom met behulp van de stroomknop en open de solenoïde klep.
De ideale combinatie van schokgolfparameters moet voldoende zijn om weefselletsel te veroorzaken, maar niet zo hoog dat het weefselcultuur insert of steriele zakvervorming of breuk veroorzaakt. Nadat u elk segment aan één schokbuisgolf hebt blootgesteld, brengt u het onmiddellijk terug naar de thermisch geregelde doos. Neem vervolgens de volgende steriele zak uit de doos en klem deze vast op het houderframe.
Voer de schakelaar soepel en snel uit om koeling van het experimentele medium te voorkomen, aangezien temperaturen onder de 37 de ontwikkeling van de schade kunnen verstoren. Zodra alle weefselkweek inserts zijn blootgesteld aan een shockwave of sham protocol, terug de weefselcultuur inserts om hun putten in u originele zes put plaat en terug te keren naar de incubator tot verdere beeldvorming. Dit beeld is een representatief voorbeeld van een schokgolf verkregen met behulp van 23 micron dikke polyester film met 55 kilopascal piek overdruk.
De schokgolfsnelheid was 440 meter per seconde. Zowel 50 als 55 kilopascal piek overdruk schokgolven veroorzaakt aanzienlijke schade die ontwikkeld in de 72 uur protocol in vergelijking met de sham groep. De schade als gevolg van een 55 kilopascal piek overdruk golf blootstelling was aanzienlijk hoger dan na 50 kilopascal op 48 uur en 72 uur, waaruit blijkt dat de ontwikkeling van de schade evenredig is aan de intensiteit van de schokgolf.
Dit beeld toont een plak 72 uren na een 50 kilopascal ontploffing. Een hoog niveau van diffuus letsel is zichtbaar. Letsel is meer uitgesproken na een 55 kilopascal piek overdruk blast.
Deze propidium jodide fluorescentie afbeelding toont een organotypic slice van een schijnexperiment. De schijnschijf toont lage niveaus van fluorescentie. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om een aseptische techniek te handhaven in de hele om besmetting van het weefsel te voorkomen en om weefselculturen snel te manipuleren, maar zeer voorzichtig om onbedoelde celschade te voorkomen.
Na deze procedure, andere methoden zoals immunofluorescentie vlekken kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat zijn de mechanismen van celdood betrokken bij blast geïnduceerd traumatisch hersenletsel? Deze techniek maakt een hoge doorvoertest voor onderzoekers op het gebied van neuroprotectie om het potentieel voor drugs te verkennen om de verspreiding van celdood en hersenweefsel na blootstelling aan blast shockgolven te voorkomen.