Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen blast skadelig traumatisk hjerneskade og kan brukes til å screene nevrobeskyttende stoffer før bruk av mer komplekse i Vivo-modeller. Den største fordelen med denne teknikken er at den bruker et laboratorieinstrument for å utsette in Vitro masse hjernevev til en sjokkbølge ved hjelp av en enkel og høy gjennomstrømningsprotokoll som gjør det mulig å skape en reproduserbar skade. Først setter du sterile spesiallaget rustfritt stål ringer inn i brønnene på en seks brønnplate.
Tilsett deretter preoppvarmet serumfritt eksperimentelt medium med propidiumjodid til brønnene, slik at medienivået ikke når over hakket på ringen. Overfør platen til inkubatoren i en time for å sikre at mediet er på 37 grader Celsius før vevskulturinnsatsene overføres. Etter en time, overføre vev kultur setter inn med organotypisk skiver fra deres vekstretter på ringene i seks brønnplaten.
Lag en prikk på innsatskanten i trestilling med en permanent markørpenn for å lette returen av innsatsene til sin opprinnelige posisjon, og merk deretter hver seks brønnplate med et unikt navn og dato og lag et kart over brønnene på hver plate, og navngi hver brønn med en bokstav og hvert stykke i brønnen med et tall, slik at hver skive har en unik identifikator. Inkuber ved 37 grader Celsius i en time for å sikre at skivene er på 37 grader Celsius umiddelbart før avbildning. En time etter overføring til eksperimentelt medium, vurdere skive helse ved raskt å forestille hver skive individuelt og sekvensielt under lav effekt.
Bruk et fluorescensmikroskop utstyrt med et passende eksitasjons- og utslippsfilter ideelt sett i et mørkt rom eller et rom med svakt lys. Hold lokket på platen når du bilde av dette. Noe kondens kan bygge seg opp på innsiden av lokket.
Hvis dette skjer, må du kort bruke en hårføner på den lave innstillingen på utsiden av lokket. Sørg for at bildeforholdene er identiske på forskjellige dager og mellom eksperimenter. Ved baseline viser sunne skiver svært lite fluorescerende farging.
Skiver som viser områder med tett rød farging indikerer kompromittert levedyktighet og bør utelukkes fra videre analyse. Til sammenligning vises fluorescens fra den sprengte skadede skiven på 72 timer her. Umiddelbart etter avbildning, fjern en vevskulturinnsats fra seks brønnplaten og overfør forsiktig innsatsen til en steril polyetylenpose som inneholder 20 milliliter forhåndsoppvarmet eksperimentelt medium bobler med 95% oksygen og 5% karbondioksid.
Fjern forsiktig eventuelle luftbobler og forsegle den sterile posen ved å vri toppen og påføre en plastklemme. Kontroller at hver sterile pose er riktig merket med platen og godt identifikasjon. Etter overføring av hver vevskultur innsats til en individuell steril pose, plasser posene og de seks brønnplatene med eksperimentelt medium i 37 grader Celsius inkubator.
Etter en time pakker du forsiktig de sterile posene med vevskulturen i plastbokser inne i en termisk regulert boks fylt med ionisert vann ved 37 grader Celsius. Vannet skal holde organotypiske skiver ved fysiologisk temperatur gjennom hele shockwave eksponeringsprotokollen. Bruk stål-toed beskyttende støvler, en laboratoriefrakk og hansker under utarbeidelsen av sjokkrøret og sjokkbølgeeksponeringen.
Bruk en blankstang til å feste den sterile poseholderrammen til støtrørets distale flens, slik at det sentrale hullet er på linje med støtrøruttaket. Sensor en, en trykkgiver, er plassert i den midterste delen av den drevne delen, og sensor to er i den distale flensen på sjokkrøret. Koble disse trykktransduserne til et oscilloskop gjennom en strømkildestrømenhet og slå på oscilloskopet.
Kontroller at støtrørets magnetventil og strømningskontroll er lukket, åpne deretter den eksterne trykkluftledningen og lad magnetventilen til 2,5 bar. Åpne sikkerhetsventilen for trykkluftsylinderen og åpne trykkregulatoren langsomt for å øke trykket til omtrent fem bar. Deretter forbereder membraner ved å kutte 23 mikron tykke polyesterark i 10 med 10 centimeter firkanter.
Forbered håndtakene fra autoklavtape og fest dem til toppen og bunnen av hver membran. Plasser en membran i bruddet og sørg for at de er sentrert. Deretter klemmer membranen med fire M24 bolter og muttere.
Mote dem sekvensielt på en diagonalt symmetrisk måte samtidig som membranene er rynkefrie. Klem en steril pose i vertikal posisjon på holderrammen, slik at overflaten av vevskulturinnsatsen med de organotypiske hippocampale skivene vender mot sjokkrøruttaket og vevskulturinnsatsen er sentrert inne i den sterile posen. For den doble membrankonfigurasjonen er sprengningstrykket avhengig av gasstrykksdiendialen mellom driveren og dobbeltbruddskammeret.
Derfor, for at membranene skal sprekke på en kontrollert måte, åpnes sikkerhetsventilen for dobbelt brudd manuelt når måltrykket er nådd. Sett på øret forsvarere og sikkerhet briller hvis ikke allerede slitt. Lukk magnetventilen.
Slå på strømenheten for strømkilde for å hente sjokkbølgedataene. Manipuler strømningskontrollknappen på støtrørets kontrollpanel for å sakte trykk på drivervolumdelen av sjokkrøret for konfigurasjon av enkeltmembran eller både drivervolumdelen og den doble brudddelen av sjokkrøret for dobbel membrankonfigurasjon. Så snart membranen brister, lukket du raskt trykkluftstrømmen ved hjelp av strømningsknappen og åpner magnetventilen.
Den ideelle kombinasjonen av shockwave parametere bør være nok til å forårsake vevsskade, men ikke så høy at det forårsaker vev kultur innsats eller steril pose forvrengning eller brudd. Etter å ha utsatt hver skive til en enkelt sjokkrørbølge, returnere den umiddelbart til den termiske regulerte boksen. Ta deretter den neste sterile posen fra esken og klem den fast på holderrammen.
Utfør bryteren jevnt og raskt for å hindre kjøling av det eksperimentelle mediet, da temperaturer under 37 kan forstyrre skadeutviklingen. Når alle vevskulturinnlegg har blitt utsatt for en sjokkbølge- eller sham-protokoll, returnerer vevskulturen til brønnene sine i deg originale seks brønnplate og går tilbake til inkubatoren inntil videre bildebehandling. Dette bildet er et representativt eksempel på en sjokkbølge oppnådd ved hjelp av 23 mikron tykk polyesterfilm med 55 kilopascal peak overtrykk.
Sjokkbølgehastigheten var 440 meter per sekund. Både 50 og 55 kilopascal peak overpressure shockwaves forårsaket betydelig skade som utviklet seg gjennom 72 timers protokollen sammenlignet med sham-gruppen. Skaden som følge av en 55 kilopascal peak overpressure bølgeeksponering var betydelig høyere enn etter 50 kilopascal på 48 timer og 72 timer, noe som viser utviklingen av skaden er proporsjonal med intensiteten av sjokkbølgen.
Dette bildet viser et stykke 72 timer etter en 50 kilopascal blast. Et høyt nivå av diffus skade er synlig. Skaden er mer uttalt etter en 55 kilopascal peak overpressure blast.
Dette propidiumjodidfluorescensbildet viser et organotypisk stykke fra et sham-eksperiment. Sham skive viser lave nivåer av fluorescens. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å opprettholde en aseptisk teknikk gjennom for å unngå forurensning av vevet og å manipulere vevskulturer raskt, men veldig forsiktig for å unngå utilsiktet celleskade.
Etter denne prosedyren kan andre metoder som immunofluorescence farging utføres for å svare på flere spørsmål som hva er mekanismene for celledød involvert i blast indusert traumatisk hjerneskade? Denne teknikken tillater en høy gjennomstrømningsanalyse for forskere innen nevrobeskyttelse for å utforske potensialet for narkotika for å forhindre spredning av celledød og hjernevev etter eksponering for blast sjokkbølger.