Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området blast skadliga traumatisk hjärnskada och kan användas för att skärmen nervskyddande läkemedel innan användning av mer komplexa i Vivo modeller. Den största fördelen med denna teknik är att den använder ett laboratorieinstrument för att exponera in Vitro massa hjärnvävnad till en shockwave med hjälp av en enkel och hög genomströmning protokoll som gör det möjligt att skapa en reproducerbar skada. För först in sterila skräddarsydda rostfria ringar i brunnarna på en sex brunnsplatta.
Tillsätt sedan förvärvda serumfritt experimentellt medium med propidium jodid till brunnarna vilket säkerställer att nivån av medium inte når över ringens skåra. Överför plattan till inkubatorn i en timme för att säkerställa att mediet är vid 37 grader Celsius innan vävnadskulturens skär överförs. Efter en timme överför vävnadskulturinlägg med organotypiska skivor från sina tillväxträtter på ringarna i sex brunnsplattan.
Gör en prick på skäret fälgen i klockan tre läge med en permanent markör penna för att underlätta att återvända skären till sin ursprungliga position, sedan märka varje sex väl plåt med ett unikt namn och datum och göra en karta över brunnarna i varje platta, namnge varje brunn med en bokstav och varje skiva i brunnen med ett nummer så att varje skiva har en unik identifierare. Inkubera vid 37 grader Celsius i en timme för att säkerställa att skivorna är på 37 grader Celsius omedelbart före avbildning. En timme efter överföring till experimentellt medium, bedöma skiva hälsa genom att snabbt avbilda varje skiva individuellt och sekventiellt under låg effekt.
Använd ett fluorescensmikroskop försett med ett lämpligt excitations- och utsläppsfilter i idealt läge i ett mörkt rum eller ett rum med svagt ljus. Håll locket på plattan vid bildtagning. Viss kondens kan bygga upp på insidan av locket.
Om detta händer, använd kort en hårtork på den låga inställningen på utsidan av locket. Se till att bildförhållandena är identiska på olika dagar och mellan experiment. Vid baslinjen, friska skivor visar mycket lite fluorescerande färgning.
Skivor som uppvisar områden med tät röd färgning indikerar äventyrad lönsamhet och bör uteslutas från ytterligare analys. Som jämförelse visas fluorescens från explosionen skadade skiva på 72 timmar här. Omedelbart efter avbildning, ta bort en vävnadskulturinsats från sex brunnsplattan och överför försiktigt insatsen till en steril polyetenpåse innehållande 20 milliliter förvättat experimentellt medium bubblat med 95%syre och 5%koldioxid.
Ta försiktigt bort eventuella luftbubblor och försegla den sterila påsen genom att vrida toppen och applicera en plastklämma. Se till att varje steril påse är korrekt märkt med plattan och brunnsidentifiering. Efter överföring av varje vävnadskulturinsats till en individuell steril påse, placera påsarna och de sex brunnsplattorna med experimentellt medium i 37 grader Celsius inkubatorn.
Efter en timme, packa försiktigt de sterila påsarna med vävnadskulturens insatser i plastlådor inuti en termisk reglerad låda fylld med joniserat vatten vid 37 grader Celsius. Vattnet bör hålla organotypiska skivor vid fysiologiska temperatur i hela shockwave exponering protokollet. Använd ståltåriga skyddsstövlar, en laboratorierock och handskar under beredningen av stötröret och chockvågsexponeringen.
Använd en blanking stav för att bult sterila påse innehavaren ram till stötröret distala flänsen se till att det centrala hålet är i linje med stötröret utlopp. Sensor en, en tryckgivare, är belägen i den mellersta delen av den drivna sektionen, och sensor två är i den distala flänsen av stötröret. Anslut dessa tryckgivare till ett oscilloskop genom en strömkällas kraftenhet och sätt på oscilloskopet.
Se till att stötrörets magnetventil och flödesreglering är stängda, öppna sedan den externa tryckluftsledningen och ladda magnetventilen till 2,5 bar. Öppna säkerhetsventilen för tryckluftscylindern och öppna tryckregulatorn långsamt för att öka trycket till cirka fem bar. Därefter förbereda membran genom att skära 23 mikron tjocka polyester ark i 10 av 10 centimeter rutor.
Förbered handtag från autoklav tejp och stick dem till toppen och botten av varje membran. Placera ett membran i brottet och se till att de är centrerade. Därefter kläm fast membranet med hjälp av fyra M24 bultar och muttrar.
Mode dem sekventiellt på ett diagonalt symmetriskt sätt samtidigt som membranen är skrynkla fria. Kläm fast en steril påse i vertikal position på hållarramen som säkerställer att vävnadskulturens yta sätter in med de organotypiska hippocampusskivorna är vänd mot stötrörets utlopp och vävnadskulturinsatsen är centrerad inuti den sterila påsen. För den dubbla membrankonfigurationen är sprängtrycket beroende av gastrycksdifferensen mellan föraren och dubbelbrottskammaren.
Därför, för membranen att brista på ett kontrollerat sätt, är dubbel brott säkerhetsventilen öppnas manuellt när måltrycken är nådda. Sätt på öron försvarare och glasögon säkerhet om inte redan slitna. Stäng magnetventilen.
Slå på den aktuella källkraftsenheten för att förvärva shockwave-data. Manipulera flödeskontrollratten på stötrörets kontrollpanel för att långsamt tryckstäcka stötrörets förarvolymsektion för enkelmembrankonfiguration eller både förarvolymsektionen och stötrörets dubbelbrottssektion för dubbelmembrankonfiguration. Så snart membranet brister, snabbt stängt tryckluftsflödet med hjälp av flödesvredet och öppna magnetventilen.
Den idealiska kombinationen av shockwave parametrar bör vara tillräckligt för att orsaka vävnadsskada men inte så hög att det orsakar vävnadskultur infoga eller sterila påsen distorsion eller bristning. Efter att ha utsatt varje skiva för en enda stötrörsvåg, returnera den omedelbart till den termiskreglerade lådan. Ta sedan nästa sterila påse från lådan och kläm fast den på hållarramen.
Utför brytaren smidigt och snabbt för att förhindra kylning av försöksmediet eftersom temperaturer under 37 kan störa skadeutvecklingen. När alla vävnadskulturinlägg har utsatts för en shockwave eller ett skenprotokoll, återvänder vävnadskulturens skär till sina brunnar i dig ursprungliga sex brunnsplattan och återvänder till inkubatorn tills vidare avbildning. Denna bild är ett representativt exempel på en shockwave erhålls med hjälp av 23 micron tjock polyesterfilm med 55 kilopascal topp övertryck.
Chockvågshastigheten var 440 meter per sekund. Både 50 och 55 kilopascal topp övertryck chockvågor orsakade betydande skada som utvecklats under hela 72 timmars protokoll jämfört med bluff gruppen. Skadan som härrör från en 55 kilopascal topp övertryck våg exponering var betydligt högre än efter 50 kilopascal vid 48 timmar och 72 timmar, visar utvecklingen av skadan är proportionell mot intensiteten i shockwave.
Den här bilden visar en skiva 72 timmar efter en 50 kilopascal blast. En hög nivå av diffus skada är synlig. Skada är mer uttalad efter en 55 kilopascal topp övertryck blast.
Denna propidiumjodidfluorescensbild visar en organotypisk skiva från ett skenexperiment. Den falska delen visar låga nivåer av fluorescens. Samtidigt försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att upprätthålla en aseptisk teknik hela för att undvika kontaminering av vävnaden och att manipulera vävnad kulturer snabbt men mycket försiktigt för att undvika oavsiktliga cellskador.
Efter detta förfarande, andra metoder som immunofluorescens färgning kan utföras för att besvara ytterligare frågor som vad är mekanismerna för celldöd inblandade i blast inducerad traumatisk hjärnskada? Denna teknik gör det möjligt för en hög genomströmning assay för forskare inom neuroprotektion att utforska potentialen för läkemedel för att förhindra spridning av celldöd och hjärnvävnad efter exponering för blast chockvågor.