Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i området smitsomme sygdomme. Med hensyn til Dengue feber, eller Chikungunya feber. Den største fordel ved denne teknik i sig selv, det er i stand til at kvantificere viral RNA på en enkel og hurtig måde.
Selv om denne metode kan give indsigt i en grundlæggende virus forskning, Det kan også anvendes til anden forskning såsom høj gennem sætte narkotika screening undersøgelse og klinisk diagnose mod menneskelige populogene vira. Større demonstration af denne metode er afgørende. Da prøveforarbejdningsstempler og et biosikkerhedsskab er vigtigt for at undgå krydskontaminering eller laboratorieinfektion.
Demonstration af proceduren vil være en adjunkt og vores tekniske assistent fra vores laboratorium. Efter forberedelse af DNA-skabelonen til RNA-standarden blandes in vivo-transskriptionsreaktionen med 100 nanogram af den forberedte DNA-skabelon i et 0,2 milliliter PCR-rør. Inkubere ved 37 grader Celsius i en termocyver i to timer.
Efter dette, tilsæt en mikroliter af DNAase og fortsætte inkubationen ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Sæt et RNA-renseanlæg, og tilsæt 80 mikroliter RNAasefrit vand og 350 mikroliter af opsamlingsbuffer, herunder 1%betamarcaptoethanol til reaktionsblandingen i et 1,5 milliliterrør. Tilsæt 250 mikroliter af 100% ethanol og brug en pipette til at blande.
Derefter samles en RNA-rensekolonne med et opsamlingsrør. Overfør RNA-prøven til rensekolonnen. Centrifuge kolonnen ved 8,000 gange G i 15 sekunder og kassér strømmen igennem.
Derefter anvendes 500 mikroliter vaskebuffer på kolonnen og centrifuge ved 8.000 gange G i to minutter. Derefter anbringes kolonnen i et mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter. Tilsæt 50 mikroliter RNAase frit vand og inkuberes ved stuetemperatur i et minut.
Centrifuge kolonnen ved maksimal hastighed i et minut til at allute RNA. Ved hjælp af et spektrofotometer måles den optiske tæthed af 3 mikroliter af det alluterede RNA ved 260 nanometer. Derefter, bestemme kopinummeret på den syntetiserede Dengue virus tre prime UTR RNA.
RNA-standarden opbevares på minus 80 grader Celsius, indtil den er klar til brug. Bland først 199 mikroliter af behandlingsbuffer med en mikroliter nukleasefri proteinase K.Brug cellekulturmedium, serielt fortynde den forberedte Denguevirus tre prime UTR RNA RNA en til ti for at opnå RNA-standarder ved koncentrationer fra 5, 000, 000 til 5. Overfør 5 mikroliter af kultursupernatanten af denguevirus inficerede celler og Dengue virus 3 prime UTR RNA-standarden til enten A2 PCR strips eller brøndene på en 96 brønd PCR plade.
Der blandes kortvarigt i fem mikroliter af opløsningen, der indeholder forarbejdningsbuffer og proteinase K.Centrifuge ved 200 gange G i fem sekunder. Inkuber prøverne i en termocyrator ved 25 grader Celsius i ti minutter og derefter ved 75 grader Celsius i fem minutter. Brug Dengue virus tre prime UTR specifikke primere og en fluorogen sonde, forberede en RTQ PCR master mix med et et trin RT PCR reagens i en 1,5 milliliter mikro centrifuge rør.
Alloquote otte mikroliter af master mix i en brønd af en 96 godt realtid PCR plade. Derefter tilsættes to mikroliter af hver prøve til hver brønd af 96 godt realtid PCR plade. Forsegle pladen med optisk klar klæbefilm.
Kort centrifuge pladerne ved 200 gange G i fem sekunder for at fjerne eventuelle luftbobler. Placer derefter pladen i et PCR-instrument i realtid. Ved hjælp af en PCR-tilknyttet software i realtid skal du navigere til opsætningsvinduet og tildele brønden af en reaktion, der skal analyseres som den ukendte prøve.
Dernæst tildele brønden af serielt fortyndet Dengue virus tre prime UTR RNA som standard og skriv det forventede kopinummer af RNA-standard i hver brønd. Tildel kontrolelementet, der ikke er skabelon, som det negative kontrolelement. Start derefter RT PCR-instrumentet, og cyklus pladen som beskrevet i tekstprotokollen.
Klik på analyse i analysevinduet, og sørg for, at korrelationskoefficienten for den genererede standardkurve svarer til eller er større end 0,98. Generelt skal du bruge standardindstillingerne for CT til analysen. I denne undersøgelse, en seriel ti-fold fortynding af standard Dengue virus RNA er udsat for en direkte RTQ PCR analyse ved hjælp af tre prime UTR specifikke primere og en fluorgen sonde.
Den lineære kurve i denne analyse viser, at korrelationen er god. Dernæst anvendes denne direkte RTQ PCR-analyse til at kvantificere Denguevirus i kultursupernatanten af virus inficerede celler. En god korrelation ses mellem Dengue virus infektion titer og CT, en cyklus nummer, der anses for at være det punkt, hvor fluorescerende signal stiger med eksponentiel vækst over baggrunden.
Når CT-værdier, der genereres fra en seriel fortynding af denguevirusbestanden med kendte infektiøse titere, afbildes på den tidligere genererede standardkurve, ses dataene for prøverne på mellem 08 og 8. Dette indikerer, at Dengue virus prøver med en bred vifte af smitsomme titere kan analyseres på samme tid, når du bruger denne teknik. Denne analyse er yderligere vurderet for sin anvendelighed til validering af anti-virale midler mod Dengue virus.
Når det behandles med 50 mikrogram pr. milliliter MPA, observeres en reduktion på ca. 99,87 % af DMSO-den behandlede kontrolkultur. Endelig testes anvendelser af denne analyse med andre RNA-vira. Når en bestand af Gul feber Virus 17D vaccine stamme er udsat for direkte RTQ PCR, en standard kurve genereres med en god direkte sammenhæng mellem virus titrer og CT-værdier.
Ligeledes giver direkte RTQ PCR-analyse af mæslingevirus og chikungunyavirus rå stamme lager en god regression mellem smitsomme titere og CT-værdier. Denne teknik vil bane vejen for forskerne inden for screeningsundersøgelse. Tillader et stort antal prøver til at udforske nye antivirale lægemidler er lig med forsimplede.
Glem ikke, at arbejde med re-infektiøse materialer kan være yderst farligt og forholdsregler såsom brug af personlige værnemidler og en ren biosikkerhed kabinet bør altid tages, når du udfører denne procedure.
