Meten van Dengue Virus RNA in het Supernatant van cultuur van geïnfecteerde cellen door Real-time kwantitatieve Polymerase-kettingreactie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van infectieziekten. Met betrekking tot Knokkelkoorts, of Chikungunya koorts. Het belangrijkste voordeel van deze techniek zelf, het is in staat om virale RNA kwantificeren op een eenvoudige en snelle manier.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in een fundamenteel virusonderzoek, kan het ook worden toegepast op ander onderzoek, zoals high through put drug screening study en klinische diagnose tegen menselijke populogene virussen. Grote demonstratie van deze methode is van cruciaal belang. Aangezien de monsterverwerkingsstempels en een bioveiligheidskast belangrijk zijn om kruisbesmetting of laboratoriuminfectie te voorkomen.

Het demonstreren van de procedure zal een assistent-professor en onze technische assistent van ons laboratorium. Na het voorbereiden van de DNA-sjabloon voor de RNA-standaard, meng de in vivo transcriptiereactie met 100 nanogrammen van de voorbereide DNA-sjabloon in een 0,2 milliliter PCR-buis. Incubeer bij 37 graden Celsius in een thermo cycler gedurende twee uur.

Voeg hierna een microliter DNAase toe en zet de incubatie 15 minuten voort bij 37 graden Celsius. Stel een RNA-zuiveringskit op en voeg 80 microliter RNAase-vrij water en 350 microliter afvangbuffers toe, waaronder 1%betamarcaptoethanol aan het reactiemengsel in een buis van 1,5 milliliter. Voeg 250 microliter van 100% ethanol toe en gebruik een pipet om te mengen.

Monteer vervolgens een RNA-zuiveringskolom met een verzamelbuis. Breng het RNA-monster over naar de zuiveringskolom. Centrifugeren de kolom op 8,000 keer G gedurende 15 seconden en gooi de stroom door.

Breng vervolgens 500 microliter wasbuffer aan op de kolom en centrifuge twee minuten op 8.000 keer G. Plaats hierna de kolom in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg 50 microliter RNAase vrij water toe en broed een minuut op kamertemperatuur.

Centrifuge de kolom op maximale snelheid gedurende een minuut om het RNA te allileren. Met behulp van een spectrofotometer meet u de optische dichtheid van 3 microliters van het alluted RNA op 260 nanometer. Bepaal vervolgens het kopieernummer van het gesynthetiseerde Dengue-virus drie prime UTR RNA.

Bewaar de RNA-standaard op min 80 graden Celsius tot het gebruiksklaar is. Meng eerst 199 microliter verwerkingsbuffer met één microliter nucleasevrije proteinase K.Met behulp van celkweekmedium verdunnen ze het voorbereide Dengue-virus drie primaire UTR RNA-RNA één tot tien om RNA-normen te verkrijgen bij concentraties variërend van 5.000, 000 tot 5.000 kopieën per microliter door pipetting en vortex te herhalen. Breng 5 microliters van de cultuur supernatant van Dengue virus geïnfecteerde cellen en de Dengue virus 3 prime UTR RNA standaard naar ofwel A2 PCR strips of de putten van een 96 goed PCR plaat.

Meng in vijf microliter van de oplossing met verwerkingsbuffer en proteinase K.Centrifuge kort op 200 keer G gedurende vijf seconden. Incubeer de monsters in een thermo cycler op 25 graden Celsius gedurende tien minuten en vervolgens op 75 graden Celsius gedurende vijf minuten. Met behulp van Dengue virus drie prime UTR specifieke primers en een fluorogene sonde, bereiden een RTQ PCR master mix met een een stap RT PCR reagens in een 1,5 milliliter micro centrifuge buis.

Alloquote acht microliters van de master mix in een put van een 96 goed real-time PCR plaat. Voeg vervolgens twee microliters van elk monster toe aan elke put van de 96 goed real-time PCR-plaat. Verzegel de plaat met optisch heldere kleeffolie.

Vercentrifugeren de platen kort op 200 keer G gedurende vijf seconden om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats de plaat vervolgens in een real-time PCR-instrument. Navigeer met behulp van een realtime pcr-gekoppelde software naar het instelvenster en wijs de put van een reactie toe die als onbekend voorbeeld moet worden geanalyseerd.

Vervolgens wijst u de put van het serieel verdunde Dengue-virus drie priemgevot RNA toe als standaard en typt u het verwachte kopieernummer van de RNA-standaard in elke put. Wijs het besturingselement niet-sjabloon toe als het negatieve besturingselement. Start vervolgens het RT PCR-instrument en fiets de plaat zoals beschreven in het tekstprotocol.

Klik in het analysevenster op analyseren en zorg ervoor dat de correlatiecoëfficiënt van de gegenereerde standaardcurve gelijk is aan of groter is dan 0,98. Over het algemeen gebruikt u de standaard-CT-instellingen voor de analyse. In deze studie wordt een seriële verdunning van het standaard Dengue-virus RNA onderworpen aan een directe RTQ PCR-analyse met behulp van drie primaire UTR-specifieke primers en een fluorgene sonde.

De lineaire curve van deze analyse toont aan dat de correlatie goed is. Vervolgens wordt deze directe RTQ PCR-test toegepast om het Dengue-virus te kwantificeren in de cultuursupernatant van met virussen geïnfecteerde cellen. Een goede correlatie wordt gezien tussen de Dengue virus infectie titer en de CT, een cyclus nummer dat wordt beschouwd als het punt waarop het fluorescerende signaal stijgt met exponentiële groei boven de achtergrond.

Wanneer CT-waarden die worden gegenereerd uit een seriële verdunning van het Dengue-virus met bekende infectieuze titers worden uitgezet op de eerder gegenereerde standaardcurve, worden de gegevens voor de monsters tussen 08 en 8, 000 PFU per reactie geacht binnen het bereik te liggen van de gegevens die aan standaardRNA worden onderworpen. Dit geeft aan dat Dengue virus monsters met een breed scala van infectieuze titers kunnen worden geanalyseerd op hetzelfde moment bij het gebruik van deze techniek. Deze test wordt verder beoordeeld op de toepasbaarheid van antivirale middelen tegen het Dengue-virus.

Wanneer behandeld met 50 microgram per milliliter MPA, wordt een vermindering van ongeveer 99.87% van de DMSO behandelde controlecultuur waargenomen. Ten slotte worden toepassingen van deze test met andere RNA-virussen getest. Wanneer een voorraad Yellow Fever Virus 17D-vaccinstam wordt onderworpen aan directe RTQ PCR, wordt een standaardcurve gegenereerd met een goede directe correlatie tussen virustiieten en CT-waarden.

Evenzo, directe RTQ PCR analyse van de mazelen virus en chikungunya virus rauwe stam voorraad geeft een goede regressie tussen infectieuze titers en CT-waarden. Deze techniek zal de weg vrijmaken voor de onderzoekers op het gebied van screeningstudie. Het toestaan van een groot aantal monsters om nieuwe antivirale geneesmiddelen te verkennen is gelijk aan simplistisch.

Vergeet niet dat het werken met re-infectieuze materialen zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en een schone bioveiligheidskast moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.