डेंगू वायरस आरएनए को मापने वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा संक्रमित कोशिकाओं की संस्कृति Supernatant में

इस विधि संक्रामक रोग क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब में मदद कर सकते हैं। डेंगू बुखार, या चिकनगुनिया बुखार के संबंध में। इस तकनीक का मुख्य लाभ, यह एक सरल और तेजी से तरीके से वायरल आरएनए की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम है।

हालांकि इस विधि एक बुनियादी वायरस अनुसंधान में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, यह भी इस तरह के उच्च डाल दवा स्क्रीनिंग अध्ययन और मानव लोकलुभावन वायरस के खिलाफ नैदानिक निदान के माध्यम से के रूप में अंय अनुसंधान के लिए लागू किया जा सकता है । इस विधि का प्रमुख प्रदर्शन महत्वपूर्ण है। चूंकि क्रॉस संदूषण या प्रयोगशाला संक्रमण से बचने के लिए नमूना प्रसंस्करण टिकटों और जैवसेफ्टी कैबिनेट महत्वपूर्ण हैं।

प्रक्रिया का प्रदर्शन एक सहायक प्रोफेसर और हमारी प्रयोगशाला से हमारे तकनीकी सहायक होगा । आरएनए मानक के लिए डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के बाद, 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में तैयार डीएनए टेम्पलेट के 100 नैनोग्राम के साथ वीवो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन में मिलाएं। दो घंटे तक थर्मो साइकिलर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

इसके बाद, DNAase का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन जारी रखें। एक आरएनए शुद्धिकरण किट सेट करें और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण में 1% बीटामार्क्टोएथेनॉल सहित आरएनएएसई मुफ्त पानी और कैप्चर बफर के 350 माइक्रोलीटर जोड़ें। 100% इथेनॉल के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें और मिश्रण करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।

फिर, एक संग्रह ट्यूब के साथ एक आरएनए शुद्धिकरण स्तंभ इकट्ठा करें। आरएनए नमूने को शुद्धिकरण कॉलम में स्थानांतरित करें। 15 सेकंड के लिए 8, 000 बार जी पर कॉलम अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से त्यागना।

इसके बाद, कॉलम में बफर धोने के 500 माइक्रोलीटर लगाएं और दो मिनट के लिए 8, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। इसके बाद कॉलम को 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें। आरएनएईस मुफ्त पानी के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।

आरएनए को तैयार करने के लिए एक मिनट के लिए अधिकतम गति से कॉलम को अपकेंद्रित्र करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, 260 नैनोमीटर पर एल्यूटेड आरएनए के 3 माइक्रोलीटर के ऑप्टिकल घनत्व को मापें। इसके बाद संश्लेषित डेंगू वायरस थ्री प्राइम यूटीआर आरएनए की कॉपी नंबर निर्धारित करें।

उपयोग करने के लिए तैयार होने तक आरएनए मानक को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सबसे पहले, नाभिक मुक्त प्रोटीन के एक माइक्रोलीटर के साथ बफर प्रसंस्करण के १९९ माइक्रोलीटर मिश्रण सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग कर, क्रमिक रूप से तैयार डेंगू वायरस तीन प्रधानमंत्री यूटीआर आरएनए एक से दस को पतला करने के लिए 5, 000, 000 से 5, 000 प्रतियां प्रति माइक्रोलीटर दोहराने से लेकर सांद्रता पर आरएनए मानकों को प्राप्त करने के लिए । डेंगू वायरस संक्रमित कोशिकाओं और डेंगू वायरस 3 प्राइम यूटीआर आरएनए मानक के कल्चर सुपरनेटेंट के 5 माइक्रोलीटर को या तो A2 पीसीआर स्ट्रिप्स या ९६ कुएं पीसीआर प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें ।

प्रसंस्करण बफर और प्रोटीन युक्त समाधान के पांच माइक्रोलीटर में मिलाएं के. सेंट्रीफ्यूज संक्षेप में 200 बार जी पर पांच सेकंड के लिए। एक थर्मो साइकिलर में नमूनों को दस मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर और फिर पांच मिनट के लिए ७५ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । डेंगू वायरस का उपयोग तीन प्राइम यूटीआर विशिष्ट प्राइमर और एक फ्लोरोजेनिक जांच, एक आरटीक्यू पीसीआर मास्टर मिश्रण एक १.५ मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में एक कदम आरटी पीसीआर रिएजेंट के साथ तैयार करते हैं ।

एक 96 अच्छी तरह से वास्तविक समय पीसीआर प्लेट के एक कुएं में मास्टर मिश्रण के आठ माइक्रोलीटर Alloquote। फिर, 96 अच्छी तरह से वास्तविक समय पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्रत्येक नमूने के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। ऑप्टिकली स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ प्लेट को सील करें।

किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए पांच सेकंड के लिए 200 बार जी पर प्लेटों को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें। इसके बाद प्लेट को रियल टाइम पीसीआर इंस्ट्रूमेंट में रखें। एक वास्तविक समय पीसीआर संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, सेट अप विंडो पर नेविगेट करें और अज्ञात नमूने के रूप में विश्लेषण की जाने वाली प्रतिक्रिया का अच्छी तरह से असाइन करें।

इसके बाद, क्रमिक रूप से पतला डेंगू वायरस के कुएं को मानक के रूप में तीन प्राइम यूटीआर आरएनए असाइन करें और प्रत्येक कुएं में आरएनए मानक की अपेक्षित कॉपी संख्या टाइप करें। गैर-टेम्पलेट नियंत्रण को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में असाइन करें। इसके बाद आरटी पीसीआर इंस्ट्रूमेंट शुरू करें और टेक्स्ट प्रोटोकॉल में बताए गए अनुसार प्लेट को साइकिल करें ।

विश्लेषण विंडो में, विश्लेषण पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि उत्पन्न मानक वक्र का सहसंबंध गुणांक 0.98 के बराबर या उससे अधिक है। आम तौर पर, विश्लेषण के लिए डिफ़ॉल्ट सीटी सेटिंग्स का उपयोग करें। इस अध्ययन में, मानक डेंगू वायरस आरएनए के धारावाहिक दस गुना कमजोर पड़ने के लिए तीन प्रमुख यूटीआर विशिष्ट प्राइमर और एक फ्लोरजेनिक जांच का उपयोग कर एक प्रत्यक्ष RTQ पीसीआर विश्लेषण के अधीन है ।

इस विश्लेषण के रैखिक वक्र से पता चलता है कि सहसंबंध अच्छा है। इसके बाद, यह प्रत्यक्ष आरटीक्यू पीसीआर परख वायरस संक्रमित कोशिकाओं की संस्कृति सुपरनैंट में डेंगू वायरस की मात्रा निर्धारित करने के लिए लागू की जाती है। डेंगू वायरस संक्रमण टाइटर और सीटी के बीच एक अच्छा सहसंबंध देखा जाता है, एक चक्र संख्या जिसे उस बिंदु पर माना जाता है जिस पर फ्लोरोसेंट सिग्नल पृष्ठभूमि के ऊपर घातीय विकास के साथ उगता है।

जब ज्ञात संक्रामक टाइटर्स के साथ डेंगू वायरस स्टॉक के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने से उत्पन्न सीटी मानों पहले से उत्पन्न मानक वक्र पर साजिश रची जाती है, तो प्रति प्रतिक्रिया 08 और 8, 000 पीएलयू के बीच के नमूनों के लिए डेटा मानक आरएनए के अधीन लोगों की सीमा के भीतर देखा जाता है। यह इंगित करता है कि संक्रामक टाइटर्स की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ डेंगू वायरस के नमूनों का विश्लेषण एक ही समय में किया जा सकता है जब इस तकनीक का उपयोग करते हैं। इस परख का आकलन डेंगू वायरस के खिलाफ एंटी-वायरल एजेंटों को मान्य करने के लिए इसकी प्रयोज्यता के लिए किया जाता है ।

जब एमपीए के मिलीलीटर प्रति 50 माइक्रोग्राम के साथ इलाज किया जाता है, तो डीएमएसओ उपचारित नियंत्रण संस्कृति के लगभग 99.87% की कमी देखी जाती है। अंत में, अन्य आरएनए वायरस के साथ इस परख के अनुप्रयोगों का परीक्षण किया जाता है। जब येलो फीवर वायरस 17D वैक्सीन तनाव का एक स्टॉक सीधे आरटीक्यू पीसीआर के अधीन होता है, तो वायरस टिटर और सीटी मूल्यों के बीच एक अच्छे सीधे संबंध के साथ एक मानक वक्र उत्पन्न होता है।

इसी तरह, खसरा वायरस और चिकनगुनिया वायरस कच्चे तनाव स्टॉक के प्रत्यक्ष आरटीक्यू पीसीआर विश्लेषण संक्रामक titers और सीटी मूल्यों के बीच एक अच्छा प्रतिगमन देता है । इस तकनीक से स्क्रीनिंग अध्ययन के क्षेत्र में शोधकर्ताओं का मार्ग प्रशस्त होगा। नई एंटीवायरल दवाओं का पता लगाने के लिए बड़ी संख्या में नमूनों की अनुमति सरलीकृत के बराबर होती है।

यह न भूलें कि पुनः संक्रामक सामग्रियों के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों और एक स्वच्छ जैव सुरक्षा कैबिनेट के उपयोग जैसे सावधानियां हमेशा ली जानी चाहिए।