この方法は、感染症分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。デング熱、またはチクングニア熱に関して。この技術自体の主な利点は、単純かつ迅速な方法でウイルスRNAを定量化することができます。
この方法は、基本的なウイルス研究への洞察を提供することができますが、また、ヒトのポピュロゲンウイルスに対する薬物スクリーニング研究や臨床診断を通じて、高などの他の研究にも応用することができます。この方法の主なデモンストレーションは重要です。サンプル加工スタンプとバイオセーフティキャビネットは、クロス汚染や実験室感染を避けるために重要です。
この手順をデモンストレーションすることは、私たちの研究室の助教授と技術アシスタントになります。RNA標準用のDNAテンプレートを調製した後、インビボ転写反応を0.2ミリリットルPCRチューブに調製したDNAテンプレートの100ナノグラムと混合します。サーモサイクラーで摂氏37度で2時間インキュベートします。
この後、1マイクロリットルのDNAaseを加え、摂氏37度で15分間インキュベーションを続けます。RNA精製キットをセットし、RNAaseフリー水80マイクロリットルと1.5ミリリットルチューブ内の反応混合物に1%ベタマルカプトエタノールを含む350マイクロリットルの捕獲バッファーを追加します。100%エタノールの250マイクロリットルを加え、混合するためにピペットを使用してください。
次いで、回収管を用いてRNA精製カラムを組み立てます。RNAサンプルを精製カラムに移します。列を8,000回Gで15秒間遠心し、流れを破棄します。
次に、500マイクロリットルの洗浄バッファーをカラムに塗布し、遠心分離機を8,000倍Gで2分間塗布する。その後、柱を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れ。50マイクロリットルのRNAaseフリー水を加え、室温で1分間インキュベートします。
RNAをアジュートするために、カラムを最大速度で1分間遠心分離します。分光光度計を用いて、260ナノメートルでの3マイクロリットルの測定を行う。次に、合成デングウイルス3素量のUTR RNAのコピー数を求める。
使用できるまで、RNA標準をマイナス80°Cで保存します。まず、199マイクロリットルの処理バッファーをヌクレアーゼフリープロテイナーゼK.を使用して、調製したデング熱ウイルス3素数UTR RNA 1~10を連続的に希釈し、ピペッティングと渦を繰り返して1マイクロリットル当たり5,000,000~5,000コピーの濃度でRNA基準を取得します。デングウイルス感染細胞の培養上清の5マイクロリットルを、デングウイルス3プライムUTR RNA標準にA2 PCRストリップまたは96ウェルPCRプレートのウェルに移します。
処理バッファーとプロテイナーゼ K.遠心分離機を含む溶液の 5 マイクロリットルを G の 200 倍に 5 秒間短時間混合します。サーモサイクラーで10分間摂氏25度で、その後摂氏75度で5分間インキュベートします。デングウイルス3つの素数UTR特異的プライマーと蛍光性プローブを使用して、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管内の1ステップRT PCR試薬とRTQ PCRマスターミックスを調製します。
マスターの8マイクロリットルを96の実時間PCR版の井戸に混ぜる。次に、各サンプルの2マイクロリットルを96ウェルリアルタイムPCRプレートのウェルに加えます。光学的に透明な粘着フィルムでプレートを密封します。
気泡を取り除くために5秒間Gの200倍のプレートを簡単に遠心分離します。次に、プレートをリアルタイム PCR 装置に入れる。リアルタイム PCR 関連ソフトウェアを使用して、セットアップ ウィンドウに移動し、分析する反応ウェルを未知のサンプルとして割り当てます。
次に、連続希釈デングウイルスのウェルを3つのプライムUTR RNAを標準として割り当て、各ウェルに期待されるRNA標準のコピー数を入力します。テンプレート以外のコントロールを負のコントロールとして割り当てます。次に、RT PCR機器を起動し、テキストプロトコルに記載されているプレートをサイクルします。
解析ウィンドウで[解析]をクリックし、生成される標準曲線の相関係数が0.98以上であることを確認します。通常、解析にはデフォルトの CT 設定を使用します。本研究では、標準デングウイルスRNAの連続10倍希釈を、3つの素数UTR特異的プライマーおよび蛍光プローブを用いた直接RTQ PCR解析を行う。
この分析の線形曲線は、相関が良好であることを示しています。次に、この直接RTQ PCRアッセイは、ウイルス感染細胞の培養上清におけるデングウイルスを定量するために適用される。デング熱ウイルス感染価とCTとの間には良好な相関関係が見られ、そのサイクル数は、バックグラウンドを上回る指数関数的な成長と共に蛍光シグナルが上昇する点であると考えられる。
既知の感染性力価を有するデングウイルスストックの連続希釈から生成されたCT値が以前に生成された標準曲線にプロットされると、反応当たり08~8,000 PFUの範囲のサンプルのデータは、標準RNAを受けるものの範囲内であることが分かる。これは、この技術を使用する場合、感染性力素の広い範囲を有するデングウイルスサンプルを同時に分析できることを示している。このアッセイは、デングウイルスに対する抗ウイルス剤の検証に対する適用性についてさらに評価される。
MPAのミリリットル当たり50マイクログラムで処理した場合、DMSO処理対照培養の約99.87%の減少が観察される。最後に、このアッセイの他のRNAウイルスとの適用がテストされる。黄熱病ウイルス17Dワクチン株のストックが直接RTQ PCRを受けると、ウイルスの力価とCT値の間に良好な直接相関を持つ標準曲線が生成されます。
同様に、麻疹ウイルスとチクングニアウイルス生株ストックの直接RTQ PCR分析は、感染力価とCT値の間に良好な回帰を与える。この技術は、スクリーニング研究の分野の研究者のための道を開きます。多数のサンプルを新しい抗ウイルス薬を探索できるようにすることは、単純に等しい。
再感染性物質の使用は非常に危険であり、この手順を実行する間は、個人の保護具や清潔なバイオセーフティキャビネットの使用などの予防措置を常に取るべきであることを忘れないでください。
