이 방법은 전염병 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 뎅기열, 또는 치쿤구냐 발열에 관해서. 이 기술 자체의 주요 장점은 바이러스 RNA를 간단하고 빠른 방식으로 정량화 할 수 있습니다.
이 방법은 기본적인 바이러스 연구에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 인간 포포로지닉 바이러스에 대한 약물 선별 연구 및 임상 진단을 넣어 높은 같은 다른 연구에 적용 할 수 있습니다. 이 방법의 주요 데모는 매우 중요합니다. 시료 처리 우표 및 생물 안전 캐비닛은 교차 오염 또는 실험실 감염을 방지하는 것이 중요합니다.
절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 조교수와 우리의 기술 조수가 될 것입니다. RNA 표준에 대한 DNA 템플릿을 준비한 후, 0.2 밀리리터 PCR 튜브에서 준비된 DNA 템플릿의 100 나노그램과 생체 내 전사 반응을 혼합한다. 2 시간 동안 열 사이클러에서 섭씨 37도에서 배양하십시오.
그 후, DNAase의 마이크로 리터 를 추가하고 15 분 동안 섭씨 37도에서 인큐베이션을 계속합니다. RNA 정화 키트를 설정하고 1.5 밀리리터 튜브의 반응 혼합물에 1%베타마카포에탄올을 포함하여 RNAase 무료 물과 350 마이크로리터의 캡처 버퍼를 80 마이크로리터를 추가합니다. 100% 에탄올250 마이크로리터를 넣고 파이펫을 사용하여 섞습니다.
그런 다음, 수집 튜브와 RNA 정화 컬럼을 조립한다. RNA 샘플을 정제 열로 옮기. 15초 동안 8, 000회 G로 컬럼을 원심분리하고 흐름을 버립니다.
다음으로, 500 마이크로리터의 세척 버퍼를 기둥에 바르고 원심분리기를 8, 000회 G에서 2분간 적용합니다. 이 후, 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 열을 배치합니다. 50 마이크로리터의 RNAase 무료 물을 넣고 실온에서 1분간 배양합니다.
RNA를 알로우기 위해 1분 동안 최대 속도로 컬럼을 원심분리합니다. 분광계를 사용하여 260 나노미터에서 알로티드 RNA3 마이크로리터의 광학 밀도를 측정합니다. 이어서, 합성된 뎅기열 바이러스의 카피 수를 3개의 주요 UTR RNA를 결정한다.
RNA 표준을 사용할 준비가 될 때까지 영하 80도에 보관하십시오. 먼저, 199마이크로리터의 미생물을 뉴클레아제 자유 단백질Ase K.using 세포 배양 배지의 마이크로리터 1개와 혼합하고, 제조된 뎅기열 바이러스 3개의 프라임 UTR RNA를 1대 10까지 희석시켜 파이프팅과 소용돌이를 반복하여 마이크로리터당 5, 000, 000~ 5, 000카피를 마이크로리터당 RNA 표준을 획득한다. 뎅기열 바이러스 감염 세포의 배양 상수 5 마이크로리터및 뎅기열 바이러스 3 프라임 UTR RNA 표준중 하나에 A2 PCR 스트립 또는 96 웰 PCR 플레이트의 우물.
가공 버퍼와 단백질을 함유한 5개의 마이크로리터를 5초 간 200회 G에서 간단히 혼합합니다. 온도 25도에서 10분 동안 온도75도에서 5분간 시료를 배양합니다. 뎅기열 바이러스 3개의 주요 UTR 특정 프라이머 및 불소 성 프로브를 사용하여 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 1단계 RT PCR 시약으로 RTQ PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
96 잘 실시간 PCR 플레이트의 우물에 마스터 믹스의 8 마이크로 리터를 알로 따옴표. 그런 다음 각 샘플의 마이크로리터 2개를 96개의 잘 실시간 PCR 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 광학적으로 투명한 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
플레이트를 200배 G로 5초 간 원심분리하여 기포를 제거합니다. 그런 다음, 실시간으로 PCR 기기에 접시를 배치합니다. 실시간 PCR 관련 소프트웨어를 사용하여 설정 창으로 이동하여 알 수 없는 샘플로 분석되는 반응의 웰을 할당합니다.
다음으로, 일련 희석 뎅기열 바이러스의 웰을 3개의 주요 UTR RNA를 표준으로 할당하고 각각의 우물에서 예상되는 복사 수의 RNA 표준을 입력한다. 템플릿이 아닌 컨트롤을 음수 컨트롤로 할당합니다. 그런 다음 RT PCR 계측기를 시작하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플레이트를 순환합니다.
분석 창에서 분석을 클릭하고 생성된 표준 곡선의 상관 관계 계수가 0.98보다 크거나 큰지 확인합니다. 일반적으로 분석에 기본 CT 설정을 사용합니다. 본 연구에서는, 표준 뎅기열 바이러스 RNA의 10배 희석은 3개의 주요 UTR 특이프라이머 및 불소성 프로브를 사용하여 직접 RTQ PCR 분석을 실시한다.
이 해석의 선형 곡선은 상관 관계가 양호하다는 것을 보여줍니다. 다음으로, 이러한 직접 RTQ PCR 분석은 바이러스 감염 세포의 배양 상수에서 뎅기열 바이러스를 정량화하기 위해 적용된다. 뎅기열 바이러스 감염 티터와 CT 사이에 좋은 상관 관계가 보이며, 형광 신호가 배경 위의 기하급수의 성장과 함께 상승하는 지점으로 간주되는 사이클 수입니다.
알려진 전염성 티터를 가진 뎅기열 바이러스 주식의 직렬 희석으로부터 생성된 CT 값이 이전에 생성된 표준 곡선에 플롯될 때, 반응당 08 과 8, 000 PFU 사이의 샘플에 대한 데이터는 표준 RNA를 실시하는 이들의 범위 내에 있는 것으로 여겨진다. 이것은 이 기술을 사용할 때 광범위한 전염성 티터를 가진 뎅기열 바이러스 샘플을 동시에 분석할 수 있음을 나타냅니다. 이 분석은 뎅기열 바이러스에 대하여 항 바이러스 에이전트를 확인하는 그것의 적용성에 대해 추가 평가됩니다.
MPA의 밀리리터 당 50 마이크로그램으로 처리하면 DMSO 처리 된 대조군 배양의 약 99.87 %의 감소가 관찰됩니다. 마지막으로, 다른 RNA 바이러스와 이 분석의 응용 프로그램이 테스트됩니다. 황열병 바이러스 17D 백신 균주의 주식이 직접 RTQ PCR을 받게 되면, 표준 곡선은 바이러스 titres와 CT 값 사이의 좋은 직접적인 상관관계로 생성된다.
마찬가지로, 홍역 바이러스와 치쿤구냐 바이러스 원시 균주 주식의 직접 RTQ PCR 분석은 전염성 티터와 CT 값 사이의 좋은 회귀를 제공합니다. 이 기술은 선별 연구 결과의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장할 것입니다. 새로운 항 바이러스 약물을 탐구하는 샘플의 큰 숫자를 허용하는 것은 단순한 동일합니다.
재감염 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 개인 보호 장비 및 깨끗한 생물 안전 캐비닛의 사용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
