Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de doenças infecciosas. Em relação à dengue, ou febre chikungunya. A principal vantagem dessa técnica em si, é capaz de quantificar o RNA viral de forma simples e rápida.
Embora este método possa fornecer insights sobre uma pesquisa básica de vírus, ele também pode ser aplicado a outras pesquisas, como o alto através de estudos de rastreamento de medicamentos e diagnóstico clínico contra vírus populogênicos humanos. A grande demonstração deste método é fundamental. Como os selos de processamento de amostras e um armário de biossegurança são importantes para evitar contaminação cruzada ou infecção laboratorial.
Demonstrando o procedimento será um professor assistente e nosso assistente técnico do nosso laboratório. Depois de preparar o modelo de DNA para o padrão RNA, misture a reação de transcrição in vivo com 100 nanogramas do modelo de DNA preparado em um tubo PCR de 0,2 mililitro. Incubar a 37 graus Celsius em um ciclo termo por duas horas.
Depois disso, adicione um microliter de DNAase e continue a incubação a 37 graus Celsius por 15 minutos. Defina um kit de purificação de RNA e adicione 80 microliters de água livre RNAase e 350 microliters de tampão de captura, incluindo 1%betamarcaptoetanol à mistura de reação em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 250 microliters de 100% etanol e use uma pipeta para misturar.
Em seguida, monte uma coluna de purificação de RNA com um tubo de coleta. Transfira a amostra de RNA para a coluna de purificação. Centrifugar a coluna a 8.000 vezes G durante 15 segundos e descartar o fluxo através.
Em seguida, aplique 500 microliters de tampão de lavagem na coluna e centrífuga a 8.000 vezes G por dois minutos. Depois disso, coloque a coluna em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 50 microliters de água livre RNAase e incubar em temperatura ambiente por um minuto.
Centrifugar a coluna em velocidade máxima por um minuto para alutar o RNA. Usando um espectógrafo, meça a densidade óptica de 3 microliters do RNA alluted a 260 nanômetros. Em seguida, determine o número de cópia do vírus da dengue sintetizado três RNA UTR prime.
Armazene o padrão RNA a menos 80 graus Celsius até estar pronto para usar. Primeiro, misture 199 microliters de tampão de processamento com um microlitr de proteína livre de nuclease K.Usando meio de cultura celular, diluir serialmente o vírus da Dengue preparado três RNA UTR prime de um a dez para obter padrões de RNA em concentrações que variam de 5.000.000 a 5.000 cópias por microliter repetindo tubos e vórtice. Transfira 5 microliters da cultura supernascida das células infectadas pelo vírus da dengue e o vírus da dengue 3 prime UTR RNA padrão para tiras A2 PCR ou os poços de uma placa PCR de 96 poços.
Misture em cinco microlitadores da solução contendo tampão de processamento e proteinase K.Centrifuge brevemente a 200 vezes G por cinco segundos. Incubar as amostras em um ciclo termo a 25 graus Celsius por dez minutos e depois a 75 graus Celsius por cinco minutos. Usando o vírus da dengue três primers específicos UTR e uma sonda fluorogênica, prepare uma mistura mestre RTQ PCR com um reagente RT PCR de um passo em um tubo micro centrífugas de 1,5 mililitro.
Aluquete oito microliters do master mix em um poço de uma placa PCR de 96 bem em tempo real. Em seguida, adicione dois microliters de cada amostra a cada poço da placa PCR de 96 bem em tempo real. Sele a placa com filme adesivo opticamente claro.
Centrifufique brevemente as placas a 200 vezes G durante cinco segundos para remover quaisquer bolhas de ar. Em seguida, coloque a placa em um instrumento PCR em tempo real. Usando um software associado ao PCR em tempo real, navegue até a janela de configuração e atribua o poço de uma reação a ser analisada como a amostra desconhecida.
Em seguida, atribua o poço do vírus da dengue diluído em série três RNA UTR prime como padrão e digitar o número de cópia esperado do padrão RNA em cada poço. Atribua o controle não-modelo como controle negativo. Em seguida, inicie o instrumento RT PCR e pedale a placa conforme descrito no protocolo de texto.
Na janela de análise, clique em analisar e certifique-se de que o coeficiente de correlação da curva padrão gerada seja equivalente ou superior a 0,98. Geralmente, use as configurações de TC padrão para a análise. Neste estudo, uma diluição em série dez vezes do RNA do vírus padrão da dengue é submetida a uma análise direta do RTQ PCR usando três primers específicos UTR e uma sonda fluorgênica.
A curva linear desta análise mostra que a correlação é boa. Em seguida, este ensaio direct RTQ PCR é aplicado para quantificar o vírus da dengue na cultura supernascida das células infectadas pelo vírus. Uma boa correlação é observada entre o titulador da infecção pelo vírus da dengue e o TC, um número de ciclo que é considerado o ponto em que o sinal fluorescente sobe com crescimento exponencial acima do segundo plano.
Quando os valores de TC gerados a partir de uma diluição serial do estoque do vírus da dengue com títulos infecciosos conhecidos são plotados na curva padrão gerada anteriormente, os dados para as amostras que variam entre 08 e 8.000 PFU por reação são vistos dentro do intervalo daqueles submetidos ao RNA padrão. Isso indica que amostras do vírus da dengue com uma ampla gama de infecciosas podem ser analisadas ao mesmo tempo ao usar essa técnica. Este ensaio é ainda mais avaliado por sua aplicabilidade para validar agentes antiviral contra o vírus da dengue.
Quando tratada com 50 microgramas por mililitro de MPA, observa-se uma redução de aproximadamente 99,87% da cultura de controle tratado do DMSO. Por fim, são testadas aplicações deste ensaio com outros vírus RNA. Quando um estoque de cepa de vacina 17D do Vírus da Febre Amarela é submetido a PCR RTQ direto, uma curva padrão é gerada com uma boa correlação direta entre os valores do vírus e os valores da tomografia computadorizada.
Da mesma forma, a análise direta do TRC rtq direto do vírus do sarampo e do vírus chikungunya bruto fornece uma boa regressão entre os valores infecciosos e os valores da tomografia computadorizada. Essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores no campo do estudo de triagem. Permitir que um grande número de amostras explore novas drogas antivirais é igual a simplista.
Não se esqueça que trabalhar com materiais reingiogáticos pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual e um armário de biossegurança limpo devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
