Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Nous tenons à remercier les centres d’hématologie pédiatrique tchèque. Ce travail a été soutenu par la subvention du ministère de la santé (NV15-28848A), ministère de la santé de l’Université l’hôpital Motol, République tchèque, Prague, République tchèque 00064203 et par le ministère de l’éducation, jeunesse et Sports NPU I nr. LO1604.

Tous les échantillons ont été obtenus avec l’informed consent des parents ou les tuteurs des enfants et l’approbation du Comité d’éthique de l’Université Charles à Prague, en République tchèque, l’étude aucun. NV15-28848A.
1. préparation des réactifs
<ol><li>Préparer 500 mL de PBS en dissolvant 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, ddH2O. ajuster le pH à 7,4 avec HCl. stériliser à l’autoclav...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

Le protocole décrit ci-dessus permet la mesure de l’activité métabolique évaluée par OCR et ECAR valeurs dans les blastes leucémiques primaires provenant de patients atteints de leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) ou leucémie myéloïde aiguë (LMA). L’avantage de la mesure à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire, c’est qu’il permet la détection du profil métabolique dans le temps réel dans les cellules vivantes. Essentiellement, toutes les étapes du protocole fourni pourraient être aj...

Le profil métabolique est l’une des principales caractéristiques des cellules et bioénergétique altérée sont désormais considérés comme une des caractéristiques du cancer1,2,3. En outre, les changements dans les paramètres métaboliques pourraient servir dans le traitement du cancer en ciblant les voies de transduction de signal ou de la machinerie enzymatique de cancer des cellules4,5,6. Sachant la prédisposition métabolique des cellules cancéreuses est donc un avantage et peut aider à améliorer le traitement actuel.
Il y a une abondance de méthodes déjà éprouvées qui peuvent évaluer l’activité métabolique des cellules en culture. Au sujet de la glycolyse, l’absorption du glucose est mesurable par le marquage radioactif, à l’aide de 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) ou taux de lactate extracellulaire mesurée par voie enzymatique7,8. Taux d’oxydation de l’acide gras est un autre paramètre métabolique mesuré par palmitate isotopiquement étiquetés9,10. Taux de consommation d’oxygène est une méthode largement utilisée pour la détermination de l’activité mitochondriale dans les cellules11,12, ainsi que de la membrane mitochondriale potentiel évaluation13,14, ATP/ADP (adénosine Adénosine-triphosphate/5′ 5′-diphosphate) ratio mesure15 ou total intracellulaire ATP mesure16. Voies qui régulent les processus métaboliques de signalisation peut être déterminée par des analyses quantitatives de protéine et peut améliorer la compréhension des mesures métaboliques17,18,19.
Cependant, toutes ces méthodes mesurent seul ou, dans le meilleur scénario, quelques paramètres métaboliques dans un échantillon en même temps. Ce qui est important, la mesure simultanée des taux de consommation d’oxygène (OCR) et taux d’acidification extracellulaire (ECAR) est possible par l’analyse de flux extracellulaire par, par exemple, Seahorse XFp Analyzer. L’OCR est un indicateur de la respiration mitochondriale et ECAR est principalement le résultat de la glycolyse (nous ne pouvons ignorer le CO2 production élever éventuellement ECAR de cellules avec une activité élevée de la phosphorylation oxydative)20. Jusqu’ici, les divers types de cellules ont été étudiés en utilisant ces analyseurs21,22,23.
Nous décrivons ici le protocole pour l’analyse de flux extracellulaire de blastes primaires (cellules de la leucémie dérivés le stade hématopoïétique immature) de patients atteints de leucémie. Au meilleur de notre connaissance, un protocole spécifique Blasts primaire n’est pas disponible encore.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

L’exigence métabolique des cellules cancéreuses peut influencer négativement la survie et l’efficacité du traitement. De nos jours, ciblage pharmaceutique des voies métaboliques est testée dans plusieurs types de tumeurs. Ainsi, la caractérisation de l’installation métabolique de cellules du cancer est inévitable afin de cibler la bonne voie afin d’améliorer le résultat global des patients. Malheureusement, dans la majorité des cancers, les cellules malignes sont assez difficiles à obtenir en plus grand nombre et la biopsie de tissu est requise. La leucémie est une exception, où un nombre suffisant de cellules leucémiques peut être isolé dans la moelle osseuse. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des cellules leucémiques de leucémie patients la moelle osseuse et l’analyse ultérieure de leur état métabolique avec analyseur de flux extracellulaire. Les cellules leucémiques sont isolés par le gradient de densité, ce qui n’altère pas leur validité. La prochaine étape de la culture aide à se régénérer, donc l’état métabolique mesuré est l’état des cellules dans des conditions optimales. Ce protocole permet d’obtenir des résultats cohérents et bien standardisées, qui pourraient être utilisées pour la thérapie personnalisée.

La figure 3 montre les courbes après test d’effort de la glycolyse et mesures de stress test cellule Mito de blastes leucémiques du BCP-ALL (leucémie lymphoblastique aiguë de la B-cellule précurseur) et les patients AML (leucémie myéloïde aiguë). Le calcul des paramètres métaboliques de ces mesures est également indiqué. 500 000 cellules / puits ont été ensemencées et toutes les mesures ont été effectuées en hexaplicates.
<p class="jo...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des cellules leucémiques de leucémie patients la moelle osseuse et l’analyse de leur état métabolique. Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires pourrait aider à mieux caractériser la demande des cellules primaires et pourrait mener à une médecine plus personnalisée.

Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés concernant l’installation de voies métaboliques dans les cellules leucémiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer le métabolisme des cellules leucémiques primaires en temps réel dans les cellules vivantes. Commencez par diluer un échantillon de moelle osseuse obtenu auprès d’un patient atteint de leucémie dans PBS à un rapport un à un.Soigneusement, superposer six millilitres de l’échantillon dilué de moelle osseuse sur six millilitres de milieu de gradient de densité fraîchement préparé dans un tube conique de 15 millilitres et séparer les cellules par centrifugation de gradient de densité. Utilisez un tuyau Pasteur pour transférer soigneusement la couche d’interface des cellules mononucléaires à un nouveau tube conique de 50 millilitres contenant cinq millilitres de PBS pour un lavage centrifugation. Ensuite, resuspendez la pastille cellulaire mononucléaire en deux millilitres de PBS stérile pour le comptage.Diluer les cellules à trois fois 10 à la concentration de sept cellules par millilitre. Et ajouter un millilitre de cellules à chacun des deux flacons T75 contenant 20 millilitres de milieu RPMI pour une incubation de 16 à 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de CO2. Pendant ce temps, pour préparer les plaques pour l’analyse du flux extracellulaire, ajouter 12,5 microlitres de solution adhésive cellulaire dans chaque puits de deux, huit plaques d’analyseur de flux bien extracellulaire.Après 20 minutes, aspirer l’adhésif cellulaire et laver chaque puits deux fois avec 200 microlitres d’eau stérile par lavage. Après le deuxième lavage, laisser les assiettes dans le capot jusqu’à ce que les puits soient secs. Et placez la cartouche du capteur à l’envers sur le banc du laboratoire.Séparez la plaque d’utilité et la cartouche de capteur de l’analyseur de flux. Et remplissez chaque puits de la plaque d’utilité avec 200 microlitres de calibrant et chaque fossé autour de l’extérieur des puits avec 400 microlitres de calibrant. Retournez la cartouche de capteur à la plaque d’utilité qui contient maintenant le calibreur et placez l’assemblage de la cartouche dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius sans CO2 pendant la nuit.Ensuite, allumez l’analyseur de flux extracellulaire et laissez-le chaud à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez les cellules du flacon à des tubes coniques de 50 millilitres pour centrifugation. Et resuspendez les granulés en un millilitre du milieu expérimental approprié pour le comptage.Resuspendez les cellules à quatre fois 10 aux six cellules dans 400 microlitres de concentration moyenne expérimentale. Et ajouter 50 microlitres de cellules dans les puits B à G de la plaque d’analyseur de flux. Et 180 microlitres du milieu expérimental dans les puits A et H comme puits de contrôle de fond.Après centrifugation lentement et soigneusement ajouter 130 microlitres du milieu expérimental aux puits B par G.Et confirmer visuellement l’adhérence stable des cellules au fond de chaque puits sous le microscope. Retournez ensuite la plaque d’analyse de flux à l’incubateur humidifié de 37 degrés Celsius sans CO2 pendant 30 minutes. 20 minutes avant la fin de l’incubation, charger les composés dans les ports d’injection appropriés de la cartouche selon le protocole expérimental tel qu’indiqué dans le tableau.Configurez ensuite le programme d’analyse de flux extracellulaire approprié. Démarrez le programme et remplacez la plaque calibrée par la plaque d’analyse lorsqu’elle est poussée. Dans un test de stress de glycolyse, seul le milieu basal est utilisé de sorte que les cellules sont privées de nutriments.Le premier paramètre obtenu est l’acidification basale qui devrait refléter la quantité de glucose stockée dans les cellules. Après la première injection, le taux d’acidification extracellulaire est augmenté à mesure que les cellules utilisent le glucose et peuvent fermenter le glucose pour lactate. L’oligomycine A dans la deuxième injection inhibe la synthase ATP et dirige ainsi les cellules à produire de l’ATP principalement par une glycolyse causant une élévation supplémentaire du taux d’acidification extracellulaire.Alors que l’injection de 2-Deoxy-D-glucose inhibe complètement la glycolyse et le taux d’acidification extracellulaire diminue. Dans le test de stress mito cellulaire, un milieu complété par la glutamine et le glucose est utilisé afin que les cellules ne soient pas privées de tous les nutriments. Le paramètre de respiration basale reflète leur état métabolique basal.Après la première injection avec l’oligomycine A, les cellules inhibent la respiration mitochondrique et passent à la glycolyse qui est représentée comme une diminution du taux de consommation d’oxygène. Les deuxième et troisième injections de FCCP cependant, découpler la production d’ATP de la respiration de sorte que les cellules consomment maintenant de l’oxygène à un rythme maximal. Et le taux de consommation d’oxygène atteint sa valeur la plus élevée.La dernière injection du mélange de rotenone et d’antimycine A inhibe complètement la respiration mitochondriale, réduisant le taux de consommation d’oxygène à presque zéro. Tout en essayant cette procédure, il est important d’évaluer le pourcentage de explosions dans l’échantillon pour s’assurer que les paramètres métaboliques des leukemiablasts ne sont mesurés. Lors de la mise en œuvre de cette méthode, une optimisation minutieuse doit être appliquée aux conditions de culture et à la normalisation des données.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine C1498 et son modèle associé leucémie Souris

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Préparation et test métabolique des co-cultures 3-dimensional sphéroïde de fibroblastes et de cellules de cancer du pancréas

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Génération rapide de cultures de murine primaire et de fibroblaste

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Transplantation intrapéritonéale pour générer une leucémie myéloïde aiguë chez la souris

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Évaluation des toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique à l’aide d’un modèle murin xénogreffé dérivé d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...