Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
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Vorremmo ringraziare i centri di ematologia pediatrica Ceca. Questo lavoro è stato sostenuto dal Grant del Ministero della salute (NV15-28848A), dal Ministero della salute della Repubblica Ceca, University Hospital Motol, Praga, Repubblica Ceca 00064203 e dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e sport NPU I nr. LO1604.

Tutti i campioni sono stati ottenuti con il informed consent dei genitori o tutori dei bambini e l'approvazione del comitato etico dell'Università del Charles a Praga, Repubblica Ceca, lo studio no. NV15-28848A.
1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Preparare 500 mL di PBS sciogliendo 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, ddH2O. regolare il pH a 7.4 con HCl. sterilizzare in autoclave.</li>
	<li>Preparare 100 mL di terr...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

Il protocollo sopra descritto consente la misurazione dell'attività metabolica valutati dai valori OCR ed ECAR primario blasti leucemici derivate da pazienti con leucemia linfoblastica acuta (tutta) o leucemia mieloide acuta (AML). Il vantaggio di misura utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare è che consente il rilevamento del profilo metabolico in tempo reale in cellule vive. Essenzialmente, ogni passo nel protocollo fornito può essere regolata a seconda del tipo di cella che si intende studiare. Qui, di...

Il profilo metabolico è una delle caratteristiche principali delle cellule e bioenergetica alterato sono ormai considerati uno dei tratti distintivi di cancro1,2,3. Inoltre, cambiamenti nel setup metabolico potrebbero essere utilizzati nel trattamento di cancro targeting per vie di trasduzione del segnale o macchinario enzimatico di cancro cellule4,5,6. Conoscendo la predisposizione metabolica delle cellule tumorali è così un vantaggio e può contribuire a migliorare la terapia corrente.
Ci sono un sacco di metodi già consolidati che può valutare l'attività metabolica delle cellule in coltura. Per quanto riguarda la glicolisi, l'assorbimento del glucosio può essere misurata mediante la marcatura radioattiva, con 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) o livelli di lattato extracellulare enzimaticamente misurato7,8. Velocità di ossidazione dell'acido grasso è un altro parametro metabolico misurato dal palmitato isotopicamente etichettato9,10. Tasso di consumo di ossigeno è un metodo ampiamente utilizzato per determinare l'attività mitocondriale in cellule11,12, insieme con la membrana mitocondriale potenziale valutazione13,14, ATP/ADP (adenosina 5 '-trifosfato di adenosina 5 '-difosfato) rapporto misura15 o totale intracellulare ATP misura16. Conosciuta per regolare i processi metabolici di vie di segnalazione potrebbero essere determinata da quantificazioni di proteina e possono migliorare la comprensione delle misure metaboliche17,18,19.
Tuttavia, tutti questi metodi misurano solo uno o, nella migliore delle ipotesi, alcuni parametri metabolici in uno campione contemporaneamente. Misura simultanea del tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) importante, può essere ottenuta per l'analisi di flusso extracellulare da, ad esempio, Seahorse XFp Analyzer. OCR è un indicatore della respirazione mitocondriale ed ECAR è principalmente il risultato della glicolisi (non possiamo ignorare CO2 produzione possibilmente elevare ECAR delle cellule con attività elevata fosforilazione ossidativa)20. Finora, i vari tipi di cellule sono stati studiati utilizzando questi analizzatori21,22,23.
Qui descriviamo il protocollo per l'analisi di flusso extracellulare di primarie blasti (cellule di leucemia derivate dal palco ematopoietica immaturo) da pazienti affetti da leucemia. Al meglio della nostra conoscenza, un protocollo specifico per esplosioni primarie non è ancora disponibile.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

Il requisito metabolico delle cellule tumorali possa influenzare negativamente la sopravvivenza e l'efficacia del trattamento. Al giorno d'oggi, targeting farmaceutici delle vie metaboliche è testato in molti tipi di tumori. Così, la caratterizzazione dell'installazione metabolica delle cellule di cancro è inevitabile al fine di mirare la via corretta per migliorare il risultato complessivo dei pazienti. Purtroppo, nella maggior parte dei cancri, le cellule maligne sono abbastanza difficili da ottenere in numeri più alti e la biopsia del tessuto è richiesta. La leucemia è un'eccezione, dove un numero sufficiente di cellule leucemiche possa essere isolato dal midollo osseo. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule leucemiche dal midollo osseo di leucemia pazienti e l'analisi successiva del loro stato metabolico mediante Analizzatore di flusso extracellulare. Le cellule leucemiche sono isolate dal gradiente di densità, che non pregiudica la loro sopravvivenza. Il prossimo passo di coltivazione li aiuta a rigenerare, così lo stato metabolico misurato è lo stato delle cellule in condizioni ottimali. Questo protocollo permette di ottenere risultati costanti e ben standardizzati, che potrebbero essere utilizzati per la terapia personalizzata.

La figura 3 Mostra le curve dopo glicolisi stress test e misurazioni di test di stress cellulare Mito di blasti leucemici dal BCP-ALL (B-cellula precursore leucemia linfoblastica acuta) e pazienti LMA (leucemia mieloide acuta). Il calcolo dei parametri metabolici da queste misure è anche indicato. 500.000 cellule per pozzetto sono state seminate e tutte le misurazioni sono state fatte in hexaplicates.
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Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento delle cellule leucemiche dal midollo osseo di leucemia pazienti e l'analisi del loro stato metabolico. Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria potrebbe contribuire a caratterizzare meglio la domanda di cellule primarie e potrebbe portare alla medicina più personalizzata.

Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave riguardanti la configurazione del percorso metabolico nelle cellule di leucemia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la misurazione del metabolismo delle cellule primarie della leucemia in tempo reale nelle cellule vive. Iniziare diluire un campione di midollo osseo ottenuto da un paziente con leucemia in PBS con un rapporto uno a uno.Con attenzione, strato sei millilitri del campione diluito di midollo osseo oltre sei millilitri di mezzo gradiente di densità appena preparato in un tubo conico da 15 millilitri e separare le cellule per centrifugazione gradiente densità. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire con cura lo strato di interfaccia delle cellule mononucleari in un nuovo tubo conico da 50 millilitri contenente cinque millilitri di PBS per un lavaggio centrifugato. Quindi, rimostrare il pellet di cellule mononucleari in due millilitri di PBS sterile per il conteggio.Diluire le cellule a una concentrazione di tre volte 10 fino alle sette cellule per millilitro. E aggiungere un millilitro di cellule a ciascuno dei due contenitori T75 contenenti 20 millilitri di mezzo RPMI per un'incubazione da 16 a 24 ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Nel frattempo, per preparare le piastre per l'analisi del flusso extracellulare, aggiungere 12,5 microlitri di soluzione adesiva cellulare in ogni pozzo di due, otto piastre di analizzatore di flusso extracellulare.Dopo 20 minuti, aspirare l'adesivo cellulare e lavare ogni bene due volte con 200 microlitri di acqua sterile per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, lasciare le piastre nel cappuccio fino a quando i pozzi sono asciutti. E posizionare la cartuccia del sensore capovolta sul banco del laboratorio.Separare la piastra di utilità e la cartuccia del sensore dell'analizzatore di flusso. E riempire ogni pozzo della piastra di utilità con 200 microlitri di calibante e ogni fossato intorno all'esterno dei pozzi con 400 microlitri di calibante. Riportare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità che ora contiene il calibrant e posizionare l'assemblaggio della cartuccia in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius senza CO2 durante la notte.Quindi accendere l'analizzatore di flusso extracellulare e lasciarlo riscaldare a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, trasferire le cellule dal pallone a tubi conici da 50 millilitri per la centrifugazione. E rimospend i pellet in un millilitro del mezzo sperimentale appropriato per il conteggio.Rimospendare le cellule a quattro volte 10 alle sei cellule in 400 microlitri di media concentrazione sperimentale. E aggiungere 50 microlitri di cellule nei pozzi da B a G della piastra dell'analizzatore di flusso. E 180 microlitri del mezzo sperimentale in pozzi A e H come pozzi di controllo dello sfondo.Dopo la centrifugazione aggiungere lentamente e accuratamente 130 microlitri del mezzo sperimentale ai pozzi da B a G.E confermare visivamente l'aderenza stabile delle cellule al fondo di ogni pozzo al microscopio. Quindi riportare la piastra di analisi del flusso all'incubatore umidificato di 37 gradi Celsius senza CO2 per 30 minuti. 20 minuti prima della fine dell'incubazione, caricare i composti nelle apposito porte dell'iniettore della cartuccia secondo il protocollo sperimentale indicato nella tabella.Quindi impostare l'appropriato programma di analisi del flusso extracellulare. Avviare il programma e sostituire la piastra di calibrant con la piastra di dosaggio quando richiesto. In una prova di stress da glicolisi, viene utilizzato solo mezzo basale in modo che le cellule siano private di sostanze nutritive.Il primo parametro ottenuto è l'acidificazione basale che dovrebbe riflettere la quantità di glucosio immagazzinata nelle cellule. Dopo la prima iniezione, il tasso di acidificazione extracellulare aumenta man mano che le cellule utilizzano il glucosio e possono fermentare il glucosio in lattato. L'oligomicina A nella seconda iniezione inibisce l'ATP sintasi e quindi indirizza le cellule a produrre ATP principalmente per glicolisi causando un'ulteriore elevazione del tasso di acidificazione extracellulare.Mentre l'iniezione di 2-Deossi-D-glucosio inibisce completamente la glicolisi e il tasso di acidificazione extracellulare diminuisce. Nella prova di stress mito cellulare, viene utilizzato un mezzo integrato con glutammina e glucosio in modo che le cellule non siano private di tutti i nutrienti. Il parametro di respirazione basale riflette il loro stato metabolico basale.Dopo la prima iniezione con oligomicina A, le cellule inibiscono la respirazione mitocondriale e passano alla glicolisi che è rappresentata come una diminuzione del tasso di consumo di ossigeno. La seconda e la terza iniezione di FCCP, tuttavia, disaccoppiano la produzione di ATP dalla respirazione in modo che le cellule ora consumino ossigeno a un ritmo massimo. E il tasso di consumo di ossigeno sale al suo valore più alto.L'ultima iniezione della miscela rotenone e antimicina A inibisce completamente la respirazione mitocondriale diminuendo il tasso di consumo di ossigeno quasi a zero. Durante il tentativo di questa procedura, è importante valutare la percentuale di esplosioni nel campione per garantire che vengano misurati solo i parametri metabolici dei leucemiablasti. Quando si implementa questo metodo, è necessario applicare un'attenta ottimizzazione alle condizioni di coltivazione e alla normalizzazione dei dati.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Un protocollo dettagliato per caratterizzare la linea cellulare murina C1498 e il suo modello associato leucemia mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Frazione subcellulare delle cellule linfonetiche croniche primarie per monitorare il traffico di proteine nucleari/citoplasmiche

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Trapianto intra-peritoneale per la generazione di leucemia mieloide acuta nei topi

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Valutazione delle tossicità associate alle cellule T del recettore dell'antigene chimerico utilizzando un modello murino di xenotrapianto derivato dal paziente per la leucemia linfoblastica acuta

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...