Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Çek Pediatrik Hematoloji merkezleri teşekkür etmek istiyorum. Bu eser yapıldı tarafından desteklenen Grant, Sağlık Bakanlığı (NV15-28848A), Sağlık Bakanlığı Çek Cumhuriyeti, Prag, Çek Cumhuriyeti 00064203 Üniversitesi Hastanesi konuşlanmıştır ve Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor NPU tarafından ben nr. LO1604.

Tüm örneklerini informed consent çocukların anne veya veliler ve Charles Üniversitesi Prag, Çek Cumhuriyeti, çalışma etik kurul onayı ile elde edilmiştir yok. NV15-28848A.
1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>PBS 500 mL 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, GKD2O. ayarlama 7.4 için pH HCl. Sterilize tarafından ısıyla eriterek hazırlayın.</li>
	<li>100 mL RPMI orta hazırlamak: L-Alanyl-Glutamine % 10 f...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

Akut lenfoblastik lösemi (ALL) ile hastalardan elde edilen birincil lösemik patlamaların OCR ve D.H.T. değerleri tarafından değerlendirildi metabolik aktivite ölçümü için yukarıda açıklanan protokolü sağlar veya akut miyeloid lösemi (AML). Bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak ölçüm gerçek zamanlı canlı hücrelerdeki metabolik profili tespiti sağlar avantajdır. Esasen, her adımda sağlanan iletişim kuralı bir çalışma planları hücre türüne bağlı olarak ayarlanmış olab...

Metabolik hücreler ana özelliklerinden biri olması ve değiştirilmiş bioenergetics şimdi kanser1,2,3işaretlerinden biri kabul edilir. Ayrıca, metabolik Kur değişiklikleri sinyal iletim yollarının veya kanser hücreleri4,5,6enzimatik makine hedefleyerek kanser tedavisinde kullanılan. Kanser hücrelerinin metabolik yatkınlık bilmek böylece bir avantajdır ve geçerli terapi artırmaya yardımcı olabilir.
Bir çok sayıda hücre kültüründe metabolik etkinliğini değerlendirmek zaten kurulmuş yöntemler vardır. Glikoliz ile ilgili, Glikoz alımı ölçülebilir radyoaktif etiketleme tarafından 2-NBDG kullanarak (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) veya hücre dışı laktat seviyeleri ölçülen enzimatik7,8. Başka bir metabolik parametre isotopically etiketli palmiat9,10tarafından ölçülen yağ asidi oksidasyon oranıdır. Oksijen tüketim oranını hücreleri11,12' mitokondrial membran potansiyeli değerlendirme13,14, ATP/ADP (adenozin birlikte mitokondrial etkinliği belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir 5 '-trifosfat/Adenozin 5 '-nükleotittir) oranı ölçümü15 veya toplam hücre içi ATP ölçümü16. Metabolik süreçleri düzenleyen bilinen yolları sinyal protein quantifications tarafından belirlenen ve metabolik ölçüleri17,18,19anlayış artırabilirsiniz.
Ancak, tüm bu yöntemler sadece bir tedbir veya en iyi senaryoda, aynı anda birkaç metabolik parametreleri bir örnek. Önemlisi, eş zamanlı ölçüm oksijen tüketim oranını (OCR) ve ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.) göre örneğin, deniz atı XFp Analyzer ekstraselüler akı analiz elde edilebilir. OCR mitokondrial solunum bir göstergesidir ve D.H.T. ağırlıklı olarak (biz CO2 üretim muhtemelen D.H.T. hücrelerinin yüksek Oksidatif fosforilasyon aktivite ile yükselen görmezden değil) glikoliz sonucu20. Şimdiye kadar çeşitli hücre tiplerinin bu Analizörleri21,22,23kullanılarak incelenmiştir.
Burada lösemi hastalarına Protokolü birincil patlamaların (olgunlaşmamış hematopoetik sahne alanı'ndan elde edilen lösemi hücreleri) hücre dışı akı analizi için açıklamak. Bizim bilgi en iyi şekilde, belirli bir iletişim kuralı birincil patlamaların henüz kullanılabilir değil.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

Kanser hücrelerinin metabolik gereksinimi hayatta kalma ve tedavi etkinliği olumsuz yönde etkileyebilir. Günümüzde, ilaç metabolik yollar hedefleme tümörler birçok türde sınanır. Böylece, kanser hücre metabolik Kur karakterizasyonu, hastaların genel sonucunu iyileştirmek için doğru yolu hedeflemek için kaçınılmazdır. Ne yazık ki, kanserlerin çoğunluğu, kötü huylu hücreleri daha yüksek miktarlarda elde etmek oldukça zordur ve doku biyopsisi gereklidir. Lösemi bir istisnadır, nerede lösemik hücreler yeterli sayıda kemik iliği ayrılmış olabilir. Burada, biz lösemi hastalarında kemik iliği lösemik hücrelerin izolasyonu ve metabolik durumlarına ekstraselüler akı Çözümleyicisi'ni kullanarak, daha sonraki analiz için detaylı bir protokol sağlar. Lösemik hücre canlılığı etkilemez yoğunluk gradient tarafından yalıtılır. Ekimi bir adım onları yeniden oluşturmak için yardımcı olur, böylece ölçülen metabolik durum optimal koşullar hücrelerde durumudur. Bu iletişim kuralı için kişiselleştirilmiş terapi kullanılabilir tutarlı, iyi standart sonuçlar elde sağlar.

BCP-ALL (B-hücre habercisi akut lenfoblastik lösemi) ve AML (Akut myeloid lösemi) hastalar, glikoliz stres testi ve lösemik patlamaların hücre Mito stres testi ölçümleri sonra eğrileri Şekil 3 gösterir. Bu ölçümler metabolik parametreleri hesaplanması da belirtilir. iyi başına 500.000 hücre tohumlari ve tüm ölçümler hexaplicates yapılmıştır.
Böylece hücrelerin besin yoks...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Burada bir protokol lösemi hastalarında kemik iliği lösemik hücrelerin izolasyonu ve metabolik durumlarına analizi için mevcut. Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi daha iyi primer hücre talep karakterize etmek için yardımcı olabilir ve daha fazla kişiselleştirilmiş tıp neden olabilir.

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Bu yöntem lösemi hücrelerinde metabolik yol kurulumu ile ilgili anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı canlı hücrelerde gerçek zamanlı olarak primer lösemi hücrelerinin metabolizmasının ölçümü sağlar olmasıdır. PBS'deki bir lösemi hastasından alınan kemik iliği örneğini bire bir oranında seyrelterek başlayın.Dikkatlice, 15 mililitrelik konik bir tüp içinde taze hazırlanmış yoğunluk gradyan orta altı mililitre üzerinde seyreltilmiş kemik iliği örnek katman altı mililitre ve yoğunluk gradyan santrifüj ile hücreleri ayırın. Mononükleer hücrelerin arayüz tabakasını, santrifüj yıkamaiçin beş mililitre PBS içeren yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe dikkatlice aktarmak için pasteur pipetkullanın. Sonra, sayım için steril PBS iki mililitre mononükleer hücre pelet resuspend.Mililitre konsantrasyonu başına yedi hücreiçin üç kez 10 hücreleri seyreltin. Ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2 bir 16 ila 24 saat kuluçka için RPMI orta 20 mililitre içeren iki T75 şişeher bir mililitre hücre ekleyin. Bu arada ekstrasellüler akı analizi için plakaları hazırlamak için, iki, sekiz iyi hücre dışı akı analizörü plakaları her kuyuiçine hücre yapışkan çözeltisi 12,5 mikrolitre ekleyin.20 dakika sonra, hücre yapıştırıcıaspire ve yıkama başına steril su 200 mikrolitre ile her iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, kuyular kuruyana kadar tabakları kaputta bırakın. Sensör kartuşu yla laboratuvar bankına ters yerleştirin.Akı analizörünün yardımcı plakasını ve sensör kartuşunu ayırın. Ve yardımcı plakanın her kuyuyu 200 mikrolitre kalibrrant ve kuyuların dışındaki her hendekle 400 mikrolitre kalibrrant ile doldurun. Sensör kartuşunu, şimdi kalibran içeren yardımcı plakaya geri döndürün ve kartuş tersini bir gecede CO2 olmadan nemlendirilmiş 37 santigrat derece kuvöze yerleştirin.Sonra ekstrasellüler akı analizörü açın ve bir gecede 37 santigrat derece sıcak sağlar. Ertesi sabah, merkezleştasyon için şişedeki hücreleri 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Ve peletleri saymak için uygun deneysel ortamın bir mililitresinde yeniden askıya alın.Deneysel orta konsantrasyon400 mikrolitre altı hücreye dört kez 10 hücreleri yeniden askıya. Ve akı analizörü plakasının G ile B kuyularına 50 mikrolitre hücre ekleyin. Ve 180 mikrolitre deneysel ortam a ve h kuyularına arka plan kontrol kuyuları olarak.Santrifüjden sonra yavaş ve dikkatli bir şekilde 130 mikrolitre deneysel ortamı n için G.'den B kuyularına ekleyin ve mikroskop altında her kuyunun dibine hücrelerin kararlı yapışmasını görsel olarak doğrulayın. Daha sonra akı analiz plakasını 30 dakika boyunca CO2 olmadan nemlendirilmiş 37 santigrat derece kuvöze geri verin. Kuluçka süresinin bitiminden 20 dakika önce, bileşikleri tabloda belirtildiği gibi deneysel protokole göre kartuşun uygun enjektör portlarına yükleyin.Sonra uygun ekstrasellüler akı analizi programı ayarlayın. Programı başlatın ve istendiğinde kalibrant plakasını analiz plakası ile değiştirin. Glikoliz stres testinde, sadece bazal ortam kullanılır, böylece hücreler besinlerden yoksun bırakılır.Elde edilen ilk parametre hücrelerde depolanan glikoz miktarını yansıtacak bazal asitleşmedir. İlk enjeksiyondan sonra, hücreler glikozu kullandıkça hücre dışı asitleşme hızı artar ve glikozu laktat için fermente edebilir. İkinci enjeksiyonda oligomisin A ATP synthase inhibe ve böylece hücre dışı asitleşme oranı daha fazla yükseklik neden bir glikoliz esas atp üretmek için hücreleri yönlendirir.2-Deoksi-D-glukoz enjeksiyonu tamamen glikoli ve ekstrasellüler asitleşme oranı düşer inhibe ederken. Hücre mito stres testinde, glutamin ve glikoz ile desteklenen bir orta böylece hücreleri tüm besin yoksun değildir kullanılır. Bazal solunum parametresi bazal metabolik durumlarını yansıtır.Oligomisin A ile ilk enjeksiyondan sonra, hücreler mitokondriyal solunumu inhibe eder ve oksijen tüketiminde azalma olarak temsil edilen glikolize geçerler. Ancak FCCP'nin ikinci ve üçüncü enjeksiyonları, ATP üretimini solunumdan ayırıyor, böylece hücreler artık maksimum hızda oksijen tüketirler. Ve oksijen tüketimi en yüksek değerine yükselir.Rotenon ve antimisin son enjeksiyonu Bir karışım tamamen neredeyse sıfıroksijen tüketimi oranını azaltarak mitokondriyal solunum inhibe. Bu prosedürü denerken, lösemi patlamalarının metabolik parametrelerinin sadece ölçülmesini sağlamak için numunedeki patlama ların yüzdesini değerlendirmek önemlidir. Bu yöntem uygulanırken, yetiştirme koşullarına ve veri normalizasyonuna dikkatli bir optimizasyon uygulanmalıdır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Fare C1498 Cep Hattı ve İlişkili Lösemi Fare Modeli Karakterizasyonu için Detaylı Protokolü

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Kanser Araştırmaları

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Primer Murine melanosit ve fibroblast kültürlerinin hızlı üretimi

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nükleer/Sitoplazmik Protein Ticaretini İzlemek Için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subsellüler Fraksiyonları

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Farelerde akut miyeloid lösemi üretmek için intra-peritoneal transplantasyon

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...