Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

ونشكر فيلامير كالسيس ويوين كوبي للغاية قراءة المخطوطة. ونحن ممتنون لراندي ين للمشورة التقنية الممتازة.

1-جيل مكتبة بروتينات البشرية خارج الخلية
<ol><li>تجميع قائمة من مستقبلات سطح الخلية أو البروتينات يفرز من الفائدة لبناء المكتبة ميكرواري البروتين. الأسر البروتين محددة (على سبيل المثال، فوق عائلة الغلوبولين المناعي) أو البروتينات أعربت بشكل انتقائي وبخاصة الخلية يمكن تحديد أنواع للدراسة.</l...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

يظل عدد كبير من مستقبلات اليتيمة في الجينوم البشري، ويواصل الشركاء المتفاعلة رواية الخروج للبروتينات خارج الخلية مع يغاندس تتسم سابقا. تحديد التفاعلات مستقبلات-يجند في الإنسان والكائنات نموذج أمر ضروري لفهم الآليات التي تملي الاتصالات الخلوية أثناء التوازن، فضلا عن التقلبات التي تؤدي ?...

ويصف الأسلوب الذي استعرض هنا طباعة مجموعة من البروتينات خارج الخلية في تنسيق ميكرواري، تليها طريقة لفحص هدفا لمصلحة ضد هذه المكتبة. لقد حددنا مولتيميريزيشن البروتين كخطوة حاسمة للكشف عن التفاعلات التي تتميز بالصلات ملزمة منخفضة. تعزيز الكشف عن هذه التفاعلات، يصف لنا بروتوكول استناداً إلى مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام من اهتمام باستخدام ميكروبيدس.
يفرز والمنظمين الرئيسيين للاتصالات الخلوية والإشارات والتفاعل مع المكروية الخلية أعرب عن سطح البروتينات (يطلق عليها مجتمعة البروتينات خارج الخلية) جنبا إلى جنب مع شركائها في التفاعل. ولذلك، أنها ضرورية في تنظيم الكثير من العمليات الفسيولوجية والمرضية. تقريبا ربع المجين البشري (إيتش فايف، 000 البروتينات) ترميز للبروتينات خارج الخلية، التي، نظراً لأهميتها وإمكانية الوصول للأدوية تم تسليمها بشكل منهجي، وتمثل أهدافا رئيسية للمخدرات التنمية1. ونتيجة لذلك، تمثل البروتينات خارج الخلية أكثر من 70% الأهداف البروتين مع العمل الدوائية المعروفة للأدوية المعتمدة على السوق، والمعروفة باسم "البروتين دروجابل". على الرغم من أهميتها ووفرة، شبكات التفاعل (أبي) البروتين البروتين خارج الخلية يظل ناقصاً اللافت للنظر في قواعد البيانات المتاحة. وهذا يعود إلى طبيعة البيوكيميائية المعقدة من البروتينات خارج الخلية، مما يحول دون توصيف استخدام التكنولوجيات المتاحة الأكثر2. أولاً، يصعب بروتينات الغشاء من جعل، هي عملية غالباً ما ينطوي على ظروف قاسية الغسيل والمنظفات؛ ثانيا، غالباً ما تفتقد البروتينات خارج الخلية التعديلات ذات الصلة بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن التي غائبة عندما ترد هذه البروتينات في عادة تستخدم أنظمة مغايرة. وأخيراً، التفاعلات بين المستقبلات، مثل مستقبلات المشارك في الخلايا المناعية، وأعرب عن غالباً ما تكون عابرة واتسمت بوشائج منخفضة جداً (كد في ميكرومتر ~ 1 إلى > 100 ميكرومتر النطاق). بالإجمال، طبيعة هذه البروتينات وملزمة تقديم الشركاء الأكثر على نطاق واسع تستخدم التكنولوجيات، مثل تقارب تنقية/قياس الطيف الكتلي (AP/MS) أو خميرة-اثنين-الهجين، غير مناسب للكشف عن التفاعلات في الفضاء خارج الخلية 2 , 3.
في محاولة للتغلب على هذه التحديات التقنية والتعجيل باكتشاف رواية تفاعلات البروتينات خارج الخلية، قمنا بتطوير تغطية عالية بروتين خارج الخلية ميكرواري4،5. [ميكروارس] توفر ميزة توليد الأسطح عالية الكثافة مع كميات صغيرة من العينة، وهي عموما قابلة لدراسات الإنتاجية العالية. وفرت الدراسات ميكرواري البروتين سابقا أفكاراً ذات الصلة في تفاعلات البروتين لعدة نموذج الكائنات، أن كانت تركز أساسا على التفاعلات سيتوسوليك أو البروتين محددة الأسر6،7، 8. وفي المقابل، قد أنجز عمل محدودة للتحقيق في تفاعلات البروتين خارج الخلية باستخدام هذه التكنولوجيا. قمنا بتطوير أسلوب ميكرواري بروتين لتمكين الدراسات عبيس ببناء مكتبة شاملة ومتنوعة جداً من البروتينات يفرزها المنقي والمستقبلات (STM) transmembrane واحد أعرب عن المجالات خارج الخلية المؤتلف (النماء) تنصهر فيها العلامات الشائعة ل تنقية تقارب4. نجاح على شاشات ميكرواري البروتين تعتمد اعتماداً كبيرا على إنشاء مكتبة البروتين ذات جودة عالية. للتعبير عن البروتين كل مكتبة والاستعلام، خلايا الثدييات أو خلايا الحشرات تفضيلي اختيرت كأنظمة تعبير مغايرة، لضمان الصحيح إضافة التعديلات بوستترانسلاشونال مثل سندات glycosylation أو الميثيل. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، حجم الاستبعاد اللوني وضوء الليزر زاوية المتعددة تناثر من التقنيات الشائعة المستخدمة لتقييم نوعية البروتين المؤتلف. مكتبة البروتين ثم رصدت على الشرائح ابوكسيسيلاني وتخزينها في-20 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل. وأوصت تركيزات البروتين تزيد من 0.4 ملغ/مل للبروتوكول هو موضح أدناه. ولذلك، قد تتطلب البروتينات منخفضة-وإذ يعرب عن خطوة تركيز قبل نموذج الطباعة والتخزين. ومع ذلك، مزايا رئيسية لهذا الأسلوب هي حجم صغير البروتين المطلوب (50 ميكروغرام من البروتين كافية لأداء > شاشات 2,000)، جنبا إلى جنب مع استهلاك البروتين الاستعلام الحد الأدنى (20-25 ميكروغرام كل التكرارات الشاشة). استخدام البروتوكول والمعدات الموصوفة هنا، وشريطة توافر المكتبات، يمكن توليد نتائج لاستعلام فردي البروتينات خلال يوم عمل واحد.
تحديا كبيرا في الكشف عن تفاعلات البروتين في البيئة خارج الخلية تنشأ من طبيعتها ضعيفة أو عابر مميز، مما يحول دون تحديد المنهجيات الأكثر استخداماً. ويحسن حساسية للكشف عن البروتين ضعف التفاعلات9،،من1011زيادة اللذة ملزمة إلى حد كبير. استناداً إلى هذا المبدأ قمنا بتطوير أسلوب مولتيميريزي البروتينات الاستعلام (معبراً عنها كالانصهار Fc) استخدام البروتين المغلفة بالخرز4،5. لتجنب أي المنظمة المحتملة من البروتين الاستعلام بوصفها عشوائية، نحن تسمية مناعي البشري غير ذي صلة ز مع Cy5 بدلاً من ذلك وإضافته جنبا إلى جنب مع البروتين الاستعلام الخرز البروتين أ، وبالتالي القضاء على أي القطع الأثرية بسبب تصريف مباشر صبغ لبروتين الفائدة. ونظرا للصلات micromolar عدة مستقبلات المشارك أزواج، يعزز المجمعات متعددي إشارة إلى نسبة الضوضاء، مقارنة بالبروتينات الاستعلام Fc-الانصهار فرزهم كالبروتينات القابلة للذوبان4.
وخلاصة القول، والهدف من هذا البروتوكول وصف إعداد الشرائح ميكرواري يحتوي على مكتبة بروتين خارج الخلية موجودة من قبل للتعرف على التفاعلات مستقبلات-يجند. نقوم بمراجعة الخطوات اللازمة للشرائح الطباعة، متبوعاً ببروتوكول لفحص بروتين تهم ضد المكتبة البروتين خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، يصف لنا طريقة للكشف المعززة من أبيس استناداً إلى ميكروبيدس لتحقيق اللذة زيادة من البروتين قيد الدراسة. التكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية الموضحة هنا تمثل نهجاً سريعة وقوية وفعالة للفحص والكشف عن أبي رواية مع انخفاض نسب إيجابية كاذبة، وعن طريق استخدام كميات ميكروغرام فقط من البروتين الاستعلام تحت التحقيق. وقد غذت هذه التكنولوجيا الدراسات المتعددة التي قدمت أفكاراً ذات الصلة في الوظائف الخلوية غير معروف سابقا ومسارات الإشارات لمجموعة متنوعة من مستقبلات12،13، بما في ذلك14من إيمونوريجولاتورس الفيروسية، ويمكن أن يستفاد من دي أورفانيزي أي البروتين خارج الخلية للفائدة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

يفرز عوامل ومستقبلات غشاء المربوطة وشركائها المتفاعلة الهيئات التنظيمية الرئيسية للاتصالات الخلوية والشروع في إشارات الشلالات خلال التوازن والمرض، وعلى هذا النحو تمثل الأهداف العلاجية الرئيسية. وعلى الرغم من أهميتها، تظل هذه الشبكات التفاعل الممثلة تمثيلاً ناقصاً إلى حد كبير في قواعد البيانات الحالية؛ ولذلك، يكون معظم البروتينات خارج الخلية لا شريك ملزمة موثقة. هذا التناقض يرجع أساسا إلى التحديات المرتبطة بدراسة البروتينات خارج الخلية، بما في ذلك التعبير عن البروتينات الوظيفية، وتقارب ضعف، وانخفاض، تفاعلات البروتين التي كثيرا ما تنشأ بين مستقبلات سطح الخلية. والغرض من هذا الأسلوب وصف طباعة مكتبة بروتينات خارج الخلية بتنسيق ميكرواري للفرز لتفاعلات البروتين البروتين. لتمكين الكشف عن التفاعلات الضعيفة، ويرد وصف أسلوب يقوم على مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام قيد الدراسة. بالإضافة إلى هذا النهج القائم على ميكروبيد مولتيميريزيشن لزيادة مولتيفالينسي، ميكرواري البروتين يتيح الكشف عن قوي لتفاعلات البروتين البروتين عابر في إنتاجية عالية. ويوفر هذا الأسلوب عينة السريع وانخفاض استهلاك--نهجاً للتعرف على التفاعلات الجديدة تنطبق على أي البروتين خارج الخلية. ويرد وصف البروتين ميكرواري الطباعة والفرز بالبروتوكول. هذه التقنية ستكون مفيدة للمحققين التماس وسيلة قوية لاكتشاف تفاعلات البروتين في الفضاء خارج الخلية.

ويرد في الشكل 1تخطيطي لسير العمل للتكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية. حالما تتوفر ميكرواري الشرائح التي تحتوي على مكتبة البروتين خارج الخلية، يمكن إكمال فحص البروتين الفائدة وتحليل البيانات خلال يوم واحد. العديد من التفاعلات الفيزيولوجية الصلة ب?...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

نقدم هنا، بروتوكولا للشاشة البروتين خارج الخلية [ميكروارس] للتعرف على التفاعلات رواية مستقبلات-يجند في إنتاجية عالية. كما يصف لنا طريقة لتحسين الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين عابر باستخدام مجمعات البروتين-ميكروبيد.

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تفاعلات البروتين البروتين من خلال تمكين الكشف عن شركاء ملزمين رواية للبروتينات خارج الخلية، سواء في الإنتاجية العالية ومع حساسية عالية. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه مع بضعة ميكروغرام من البروتين، يمكنك توليد مئات الشرائح باستخدام طابعة الصفيف الصغير. استخدم صفيف صغير قياسي لطباعة الشرائح.هذا الصك لديه قدرة 57 الشرائح لكل تشغيل، ويستخدم رأس الطباعة عقد 48 دبابيس اكتشاف، ويمكن أن تستوعب ما يصل إلى 8،000 البقع في كل شريحة. توليد لوحات العمل باستخدام 384 لوحات البئر في 10 ميكرولترات من عينة في بئر من لوحات الأسهم. تنفيذ هذه الخطوة يدوياً، قبل طباعة الشريحة باستخدام الصفيف الصغير.ثم البروتينات بقعة مع نوع ريشة اكتشاف دبابيس على الشرائح سيلاني الايبوكسي في 60٪ الرطوبة لمنع جفاف بقع البروتين. يمكن رصد Cy3 المسمى الألبوم المصل البقري في مكررة بين كل عينة البروتين لتصور مجموعة لتركيب قناع. بعد الطباعة، قم بإزالة شرائح الصفيف الصغير البروتيني من البيئة المرطبة.بعد ذلك ، استخدم جهاز ضباب بالموجات فوق الصوتية لتوليد ضباب ناعم من حل الحجب الذي يستقر على سطح الشريحة. ثم، كتلة الشرائح بين عشية وضحاها مع 5٪ من الحليب في PBST لسن السطح. تخزين الشرائح في ناقص 20 درجة مئوية في 50٪ الجلسرين لمنع التجمد.غالباً ما تتميز التفاعلات بين البروتينات خارج الخلية بتقارباتها المنخفضة. لتمكين الكشف عن هذه التفاعلات، من خلال زيادة تعطش ملزمة، وضعنا نهجا متعدد التكافؤ على أساس التقاط البروتين المُسَلَف الذي تم التعبير عنه كـ FC الموسومة بالمجالات خارج الخلية على البروتين A الخرز الصغير المغلف. تدور الناقل IgG، التي تم المسمى مع Cy5 أحادية التفاعلية صبغة كما هو موضح في بروتوكول النص.لحساب نسبة المول للبروتين الاستعلام و Cy5 IgG، تقسيم الوزن الجزيئي للبروتين الاستعلام على الوزن الجزيئي للIgG وضرب 40 ميكروغرام لكل ملليلتر لتحديد تركيز Cy5 IgG اللازمة. مرة واحدة وقد تم تحديد جميع النسب شكل مجمع البروتين الخرزة الصغيرة من خلال الجمع بين الاستعلام FC الموسومة و Cy5 IgG مع البروتين الخرز الصغير. اخلطي التعليق في برنامج تلفزيوني على دوار أنبوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومحمية من الضوء.لبدء الفحص، تدفئة الشرائح المعدة في درجة حرارة الغرفة قبل التحميل على محطة التهجين. لإجراء الفرز، أولا غسل مجموعة صغيرة مع PBST لمدة دقيقة واحدة لإزالة الجلسرين المتبقية. تحميل 200 ميكرولترات من واحد ملليغرام لكل ملليلتر بروتين A في برنامج تلفزيوني 5٪ الحليب واحتضان لمدة 30 دقيقة لمنع البروتين غير مُجمّع الخرز الصغير من ملزمة للبروتينات الموسومة FC التي قد تكون موجودة في مجموعة صغيرة.بعد محطة التهجين يغسل الشرائح مع PBST، تحميل 200 ميكرولترات من مجمع حبة صغيرة الاستعلام، في وجود ملليغرام واحد لكل ملليلتر البروتين A واحتضان لمدة 30 دقيقة. بعد التهجين وغسل الشرائح من قبل محطة التهجين، شطف الشرائح بالماء ووضعها في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر الفردية. جفف الأنابيب عن طريق الدوران بمعدل 900 مرة G لمدة خمس دقائق.وأخيرا، قم بمسح الشرائح باستخدام ماسح ضوئي للصفيف الصغير مناسب للكشف عن Cy3 و Cy5 fluorescence بواسطة 532 و 635 نانومتر على التوالي. تظهر هنا صورة تمثيلية لشريحة مطبوعة. وCy3 المسمى البوفين المصل بقع الألبومين في الأخضر.وطُبعت هذه البقع في شكل نسخة مكررة باعتبارها مراقبة لجودة عملية الطباعة. تظهر هنا النتائج التمثيلية للبروتين اليتيم، الذي تم فحصه لتحديد شركاء الربط باستخدام تقنية الصفيف البروتيني الصغير خارج الخلية. يتم تحديد النقاط الحمراء المكررة كضربة لبروتين الاستعلام الذي تم فحصه.هذه الطريقة التي يتم وصفها هي تنوعا للغاية ويمكن استخدامها لطباعة سلسلة من المكتبات البروتين، ما إذا كانت الأسر البروتين محددة أو مجموعات كبيرة من البروتينات مثل لنا. يمكن تقييم أي بروتين من الفائدة. في أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم التعامل مع الشرائح بعناية والتأكد من أنها لا تجف لمنع فقدان نشاط البروتينات المطبوعة.بعد شاشة البروتين من الفائدة، ينصح بشدة للتحقق من صحة أي يضرب لوحظ باستخدام تقنيات متعامد، مثل الرنين البلازمون السطحي. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة تفاعلات البروتين خارج الخلية في البشر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

تجارب NMR عالية الضغط للكشف عن حالات المطابقة منخفضة البروتين

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

مقايسة مضان الكالسيوم "مزدوجة الإضافة" للفحص عالي الإنتاجية لمستقبلات البروتين G المؤتلف

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

تحسين معلمات الفرز الخلوي للتدفق لعزل وتنقية الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

تبلور البروتين عالي الإنتاجية عن طريق غسيل الكلى

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...