Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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我们感谢菲拉默·卡尔和神户圆对手稿的批判性阅读。我们感谢任志刚提供的优秀技术咨询。

1. 细胞外人类蛋白质库的生成
<ol><li>编制一份细胞表面受体或感兴趣的分泌蛋白列表, 以建立蛋白质微阵列库。特定的蛋白质家族 (例如, 免疫球蛋白超家族) 或在特定细胞类型中选择性表达的蛋白质可以选择进行研究。</li>
	<li>对于细胞表面受体, 通过使用软件工具识别信号肽和跨膜区域来确定细胞外域 (ecd) 边界。一些在网上免费提供的相关工具, 在材料表 15、<sup class="...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

大量的孤立受体仍然存在于人类基因组中, 新的相互作用的伙伴继续出现的细胞外蛋白与以前的特征配体。定义人类和模型生物中的受体配体相互作用对于了解在稳态过程中决定细胞通信的机制以及导致疾病的失调至关重要, 因此为新的或改进的机制提供信息治疗方案。然而, 广泛使用的技术检测细胞外蛋白相互作用是一个重要的障碍, 主要原因是与细胞受体及其相互作用伙伴的生物化学相关的技?...

本文回顾的方法描述了以微阵列格式打印细胞外蛋白的方法, 然后是针对该库筛选感兴趣的目标的方法。我们已经确定蛋白质多化是检测以低结合亲和力为特征的相互作用的关键一步。为了加强对这些相互作用的检测, 我们描述了一种基于使用微珠对感兴趣的查询蛋白进行多聚合的协议。
分泌和细胞表面表达的蛋白质 (统称为细胞外蛋白) 及其相互作用的伙伴是细胞通信、信号传递和与微环境相互作用的关键调节剂。因此, 它们对于调节许多生理和病理过程至关重要。大约四分之一的人类基因组 (5, 000 蛋白质) 编码细胞外蛋白, 鉴于其对系统交付药物的重要性和可获得性, 是药物开发的关键目标1。因此, 细胞外蛋白占市场上已知的药物药理作用的蛋白质靶点的70% 以上, 被称为 "可吸毒蛋白质组"。尽管细胞外蛋白-蛋白质相互作用 (eppi) 网络的重要性和丰富性, 但在现有数据库中的代表性仍然明显不足。这从根本上说是由于细胞外蛋白的复杂生化性质, 从而使其无法使用最可用的技术进行表征2。首先, 膜蛋白很难溶解, 这一过程通常涉及苛刻的洗涤条件和洗涤剂;其次, 细胞外蛋白往往缺乏相关的翻译后修饰, 如糖基化, 当这些蛋白质表达在常用的异源系统中时, 糖基化是不存在的。最后, 受体之间的相互作用, 如在免疫细胞上表达的共同受体, 往往是短暂的, 并具有非常低的亲和力 (kd 在~ 1μm 到 & gt;100 μm 范围) 的特点。总之, 这些蛋白质的性质及其结合伙伴提供了最广泛使用的技术, 如亲和力净化/质谱 (ap/ms) 或酵母-双杂交, 不适合检测细胞外空间中的相互作用2,(三)有什么问题吗？
为了克服这些技术挑战, 加速发现细胞外蛋白的新相互作用, 我们开发了一个高覆盖率的细胞外蛋白微阵列 4,5。微阵列具有用少量样品生成高密度表面的优势, 通常适合进行高吞吐量研究。基于蛋白质微阵列的研究先前为几种模型生物的蛋白质相互作用提供了相关的见解, 尽管主要集中在细胞质相互作用或特定的蛋白质家族6,7, 8。相反, 利用这项技术研究细胞外蛋白相互作用的工作有限。我们开发了一种蛋白质微阵列方法, 通过构建一个全面和高度多样化的纯化分泌蛋白和单个跨膜 (stm) 受体库, 将其作为重组细胞外域 (ecd) 融合, 从而能够对 eppi 进行研究。常见的亲和纯化标签 4。蛋白质微阵列屏幕的成功在很大程度上取决于高质量蛋白质库的建立。对于培养蛋白和查询蛋白的表达, 优先选择哺乳动物细胞或昆虫细胞作为异源表达系统, 以确保正确添加翻译后修饰, 如糖基化或二硫化键。sds-page、尺寸排除色谱和多角度激光散射是评估重组蛋白质量的常用技术。然后, 蛋白质库被发现在环氧硅烷幻灯片上, 并存储在-20°c, 供长期使用。下面所述的协议建议蛋白质浓度超过 0.4 mgml。因此, 低表达的蛋白质可能需要在样品打印和储存之前采取浓缩步骤。然而, 这种技术的一个主要优点是所需的蛋白质体积小 (50 微克的蛋白质足以执行和 gt;2,000 屏幕), 同时只需极少的查询蛋白消耗 (每个重复屏幕20-25 微克)。使用此处描述的协议和设备, 并在库可用的情况下, 可以在一个工作日内生成单个查询蛋白的结果。
检测细胞外环境中蛋白质相互作用的一个主要挑战来自于它们的典型弱或瞬态性质, 这使得最常用的方法无法识别。提高结合亲和力大大提高了检测弱蛋白相互作用的灵敏度9,10, 11.基于这一原理, 我们开发了一种使用蛋白质 a 包覆珠子 4,5对查询蛋白 (表示为 fc 融合) 进行多聚化的方法。为了避免任何潜在的失活查询蛋白的随机标记, 我们改为标记一个不相关的人类免疫球蛋白 g 与 cy5, 并将其与查询蛋白一起添加到蛋白质 a 珠子, 从而消除任何伪影, 由于直接共轭的染料的蛋白质的利益。考虑到几个共受体对的微孔亲和力, 与筛选为可溶性蛋白的 fc 融合查询蛋白相比, 多价复合物大大提高了信噪比 4.
总之, 该协议的目标是描述微阵列幻灯片的制备, 其中包含预先存在的细胞外蛋白库, 用于识别受体配体相互作用。我们回顾了幻灯片打印的步骤, 然后是一个针对细胞外蛋白库筛选感兴趣的蛋白质的协议。此外, 我们还介绍了一种基于微珠的增强 eppi 检测方法, 以提高所研究的蛋白质的亲和力。这里描述的细胞外蛋白微阵列技术为筛选和检测低假阳性比的新型 eppi 提供了一种快速、可靠和有效的方法, 并且仅利用了查询蛋白的微克量。调查。这项技术推动了多项研究, 这些研究为以前未知的细胞功能和各种受体的信号通路提供了相关的见解, 包括病毒免疫调节剂14,可以用来去孤儿任何细胞外蛋白质的利益。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

分泌因子、膜相连受体及其相互作用的伙伴是细胞通信的主要调节器, 并在稳态和疾病期间启动信号级联, 因此是主要的治疗靶点。尽管这些互动网络具有相关性, 但在现有数据库中的代表性仍然严重不足;因此, 大多数细胞外蛋白没有记录的结合伙伴。这种差异主要是由于与细胞外蛋白的研究相关的挑战, 包括功能蛋白的表达, 以及细胞表面受体之间经常建立的弱、低亲和力、蛋白质相互作用。这种方法的目的是描述打印细胞外蛋白库的微阵列格式, 以筛选蛋白质-蛋白质相互作用。为了能够检测弱相互作用, 描述了一种基于查询蛋白多化的方法。结合这种基于微珠的多聚化方法, 提高多价, 蛋白质微阵列允许在高吞吐量下对瞬态蛋白-蛋白质相互作用进行可靠的检测。这种方法提供了一种快速和低样本的方法, 用于识别适用于任何细胞外蛋白的新相互作用。介绍了蛋白质微阵列的制备和筛选方案。这项技术将有助于研究人员寻求一种可靠的方法来发现细胞外空间中的蛋白质相互作用。

细胞外蛋白微阵列技术的工作流程示意图如图 1所示。一旦含有细胞外蛋白库的微阵列幻灯片可用, 即可在一天内完成感兴趣的蛋白质筛选和数据分析。膜内化受体之间许多生理上相关的相互作用的特点是非常弱的结合强度 (kd在微摩尔范围内)。为了提高对这种相互作用的检测能力, 提出了一种基于查询蛋白 (以 fc 融合表示) 的方法, 该方法对 a...

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Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

在这里, 我们提出了一个方案来筛选细胞外蛋白微阵列, 以识别新的受体配体相互作用在高通量。我们还描述了一种利用蛋白质微珠复合物来增强瞬态蛋白相互作用的检测方法。

低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

这种方法有助于回答蛋白质相互作用领域的关键问题，使细胞外蛋白质的检测具有新的结合性，既具有高通量，又具有高灵敏度。这种方法的主要优点是，只需几微克的蛋白质，就可以使用微阵列打印机生成数百张幻灯片。使用标准微型阵列进行幻灯片打印。该仪器的容量为每次运行 57 张幻灯片，使用包含 48 个斑点引脚的打印头，每张幻灯片最多可容纳 8，000 个点。使用 384 个井板生成工作板，每孔从库存板中收集 10 微升样品。在使用微阵列进行幻灯片打印之前手动执行此步骤。然后在60%湿度下将带毛刺型斑点针的蛋白质发现到环氧硅烷上滑动，以防止蛋白质斑点脱水。Cy3标记牛血清白蛋白可以在每个蛋白质样本之间重复发现，以可视化掩码拟合阵列。打印后，从加湿环境中取出蛋白质微阵列幻灯片。接下来，使用超声波雾器生成沉淀到滑动表面的阻塞溶液的细雾。然后，用 PBST 中的 5% 牛奶在一夜之间阻塞幻灯片，以对表面进行测量。将幻灯片存放在零下 20 摄氏度的 50%甘油中，以防止结冰。细胞外蛋白之间的相互作用通常以低亲和力为特征。为了能够检测这些相互作用，通过增加结合的狂热性，我们开发了一种基于捕获查询蛋白的多价方法，这些蛋白表示为蛋白质 A 涂层微珠上的 FC 标记细胞外域。旋转带的载波IgG，该载波已标有Cy5单一反应染料，如文本协议中所述。要计算查询蛋白和Cy5 IgG的摩尔比，将查询蛋白的分子量除以IgG的分子量，乘以每毫升40微克，以确定所需的Cy5 IgG的浓度。一旦确定所有比率形成微珠蛋白复合物，结合FC标记查询和Cy5 IgG与蛋白质 A 微珠。在室温下将 PBS 中的悬架混合在管旋转器上 30 分钟，防止光线。要开始筛选，请先在室温下加热准备好的幻灯片，然后再装载到杂交站。要执行筛选，请先用 PBST 清洗微阵列一分钟，以去除残留的甘油。在PBS 5%牛奶中加载200微升1毫克每毫升蛋白质 A，孵育30分钟，以防止未合成的蛋白质微珠与微阵列中可能存在的FC标记蛋白结合。杂交站用PBST清洗幻灯片后，加载200微升的查询微珠复合物，每毫升蛋白质 A 含量为1毫克，孵育30分钟。杂交站对滑梯进行杂交和清洗后，用水冲洗滑梯，并将它们放在单独的 50 毫升锥形管中。在 900 次 G 下旋转 5 分钟，将管材干燥。最后，使用适合检测 Cy3 和 Cy5 荧光的微型阵列扫描仪扫描幻灯片，分别以 532 和 635 纳米的速度检测 Cy3 和 Cy5 荧光。此处显示的是打印幻灯片的代表性图像。Cy3 标记的牛血清白蛋白斑为绿色。这些斑点是重复打印的，作为印刷过程的质量控制。此处显示了一种孤立的蛋白质的代表性结果，该结果经过筛选，用于识别使用细胞外蛋白微阵列技术进行结合伙伴的识别。重复的红色斑点被识别为筛选查询蛋白的命中。这种方法是高度通用的，可用于打印各种蛋白质库，他们特定的蛋白质系列或蛋白质的大型汇编，如我们的。任何感兴趣的蛋白质都可以被评估。在尝试此过程时，必须小心处理幻灯片，并确保它们不会干涸，以防止打印的蛋白质的活动损失。在感兴趣的蛋白质的屏幕之后，强烈建议进一步验证使用正交技术（如表面质感共振）观察到的任何命中。这项技术在开发之后，为研究人员研究细胞外蛋白质在人类中的相互作用铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

从Cryomilled哺乳动物细胞中的蛋白质复合物亲和捕获

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

科研

生物化学

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

方法确定HCN1和TRIP8b之间蛋白 - 蛋白相互作用的小分子抑制剂

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

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We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

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细胞细胞接触物蛋白质-蛋白质相互作用的荧光波动光谱测定

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

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使用微尺度热泳测量蛋白质-脂质相互作用

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用于重组G蛋白偶联受体高通量筛选的“双加法”钙荧光测定

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Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

小细胞外囊泡高通量分离纯化的流式细胞术分选参数优化

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

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通过微透析 实现 高通量蛋白质结晶

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...