Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Vi takker Philamer Calses og Kobe Yuen for kritisk læsning af manuskript. Vi er taknemmelige for Randy Yen for fremragende teknisk rådgivning.

1. generation af et bibliotek af ekstracellulære humane proteiner
<ol><li>Udarbejde en liste over celle overfladen receptorer eller udskilles proteiner af interesse at bygge protein microarray bibliotekets. Specifikke protein familier (for eksempel immunoglobulin superfamilien) eller proteiner udtrykte selektivt især celle typer kan være udvalgt til undersøgelsen.</li>
	<li>For celle overfladen receptorer, bestemme de ekstracellulære domæne (ECD) grænser ved at identificere signal peptid og transmembrane område...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

Et betydeligt antal forældreløse receptorer forblive i det menneskelige genom, og romanen interagerende partnere fortsat opstår for ekstracellulære proteiner med tidligere karakteriseret ligander. Definere receptor-ligand interaktioner i menneske og modelorganismer er vigtigt at forstå de mekanismer, der er bestemmende for cellulære kommunikation under homøostase, samt dysregulering fører til sygdom, og derfor informere nye eller forbedrede terapeutiske valgmuligheder. Ikke desto mindre har påvisning af ekstrace...

Metoden gennemgået her beskriver udskrivning af en samling af ekstracellulære proteiner i et microarray format, efterfulgt af en metode til screening af et mål af interesse mod dette bibliotek. Vi har identificeret protein multimerization som et afgørende skridt til påvisning af interaktioner kendetegnet ved lav bindende tilhørsforhold. For at forbedre detektion af disse interaktioner, beskriver vi en protokol baseret på multimerization af forespørgslen protein af interesse ved hjælp af microbeads.
Udskilles og celle overflade-udtrykte proteiner (kollektivt betegnet ekstracellulære proteiner) samt deres interagerende partnere er nøglen regulatorer af cellulære kommunikation, signalering og interaktion med mikromiljø. De er derfor vigtige i reguleringen af mange fysiologiske og patologiske processer. Ca. en fjerdedel af det menneskelige genom (≈5, 000 proteiner) koder for ekstracellulære proteiner, som får deres betydning og tilgængelighed til systematisk leverede lægemidler, repræsenterer centrale mål for drug udvikling1. Derfor udgør ekstracellulære proteiner mere end 70% af protein mål med kendte farmakologiske virkning for godkendte lægemidler på markedet, kendt som "druggable proteomet". Trods deres betydning og overflod forbliver de ekstracellulære protein-protein interaktion (ePPI) net bemærkelsesværdigt underrepræsenterede i de tilgængelige databaser. Dette er grundlæggende på grund af den komplekse biokemiske karakter af de ekstracellulære proteiner, som er til hinder for deres karakterisering, benytter de fleste tilgængelige teknologier2. For det første er Membranproteiner vanskeligt at solubilize, en proces, der involverer ofte barske vask betingelser og rengøringsmidler; for det andet mangler ekstracellulære proteiner ofte relevante posttranslationelle modifikationer som glykosylering, der er fraværende, hvis disse proteiner er udtrykt i almindeligt brugt heterolog systemer. Endelig, interaktioner mellem receptorer, såsom Co receptorer udtrykt på immunceller, er ofte forbigående og karakteriseret ved meget lav tilhørsforhold (KD i ~ 1 μM til > 100 μM range). Helt, arten af disse proteiner og deres bindende partnere gøre mest udnyttede teknologier, såsom affinitet rensning/massespektrometri (AP/MS) eller gær-to-hybrid, uegnet til påvisning af interaktioner i det ekstracellulære rum 2 , 3.
I et forsøg på at overvinde disse tekniske udfordringer og fremskynde opdagelsen af nye interaktioner for ekstracellulære proteiner, har vi udviklet en høj dækning ekstracellulære protein microarray4,5. Microarrays giver fordelen at generere high-density overflader med små mængder af prøven, og er generelt indstillet til høj overførselshastighed undersøgelser. Protein microarray-baserede undersøgelser har tidligere givet relevant indsigt i protein interaktioner for flere modelorganismer, omend hovedsagelig fokusere på cytosole interaktioner eller på specifikke protein familier6,7, 8. Derimod er begrænset arbejde gjort for at undersøge ekstracellulære protein interaktioner ved hjælp af denne teknologi. Vi har udviklet et protein microarray metode for at aktivere undersøgelser af ePPIs ved at bygge en omfattende og meget forskelligartede bibliotek af renset udskilles proteiner og enkelt transmembrane (STM) receptorer udtrykt som rekombinant ekstracellulære domæner (ECD) smeltet til fælles tags for affinitet rensning4. Succesen med protein microarray skærme er stærkt afhængig af etableringen af en høj kvalitet protein bibliotek. Udtryk for både biblioteket og forespørgsel protein, blev pattedyrsceller eller insekt celler fortrinsvis valgt som Heterolog ekspression systemer, at sikre korrekt tilføjelse af posttranslationelle modifikationer såsom glykosylering eller disulphide obligationer. SDS-PAGE, størrelse udstødelse kromatografi og multi-vinkel laserlys spredning er teknikker almindeligvis anvendes til at vurdere rekombinante protein kvalitet. Biblioteket protein er derefter spottet på epoxysilane dias og opbevares ved-20 ° C til lang tids brug. Protein koncentrationer over 0,4 mg/ml anbefales til protokollen beskrevet nedenfor. Derfor, lav-udtrykte proteiner kan kræve en koncentration skridt før prøven udskrivning og opbevaring. Ikke desto mindre en Hovedfordelen ved denne teknik er den lille mængde af protein kræves (50 μg af protein er tilstrækkeligt til at udføre > 2.000 skærme), sammen med minimal forespørgsel protein forbrug (20-25 μg pr. dubletter skærm). Ved hjælp af protokollen og udstyr beskrevet her, og forudsat at biblioteker er tilgængelige, resultater for individuelle forespørgsel proteiner kan genereres inden for én arbejdsdag.
En stor udfordring i forbindelse med afsløring protein interaktioner i det ekstracellulære miljø udspringer af deres karakteristisk svage eller forbigående karakter, som er til hinder for identifikation af mest almindeligt anvendte metoder. Stigende bindende aviditet høj grad forbedrer følsomheden for påvisning af svage protein interaktioner9,10,11. Baseret på dette princip, vi udviklet en metode til at multimerize forespørgsel proteiner (udtrykt som Fc fusion) ved hjælp af protein A-belagte perler4,5. For at undgå enhver potentiel inaktivering af forespørgsel protein ved tilfældige mærkning, vi i stedet mærke en irrelevant Humant immunglobulin G med Cy5 og tilføje det sammen med forespørgslen protein til protein A perler, hvilket eliminerer enhver artefakter på grund af den direkte konjugation af en farvestof til protein af interesse. I betragtning af de micromolar tilhørsforhold af flere Co receptor par, multivalent komplekser i høj grad øge signal til støjforhold, i forhold til Fc-fusion forespørgsel proteiner screenet som opløselige proteiner4.
Sammenfattende er er målet med denne protokol at beskrive forberedelse af microarray dias indeholder en allerede eksisterende ekstracellulære protein bibliotek for identifikation af receptor-ligand interaktioner. Vi gennemgår trin for dias udskrives, efterfulgt af en protokol til screening af en protein af interesse mod ekstracellulære protein bibliotek. Desuden, vi beskriver en metode til forbedret detektion af ePPIs baseret på microbeads at opnå øget aviditet af protein under undersøgelsen. Den ekstracellulære protein microarray teknologi beskrevet her repræsenterer en hurtig, robust og effektiv tilgang til screening og afsløre roman ePPI med lav falsk-positive nøgletal, og ved at udnytte eneste mikrogram mængder af forespørgsel protein under undersøgelsen. Denne teknologi har næret flere undersøgelser, der har fastsat en række receptorer12,13, herunder viral immunoregulators14, relevant indsigt i hidtil ukendt cellulær funktion og signalering veje og kan udnyttes til at de-orphanize nogen ekstracellulære protein af interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

Udskilles faktorer, membran-bundet receptorer og deres interagerende partnere er vigtigste regulatorer af cellulære kommunikation og indledningen af signalering cascades under homøostase og sygdom, og som sådan repræsenterer primære terapeutiske mål. Trods deres relevans fortsat nettene interaktion markant underrepræsenterede i nuværende databaser; Derfor har mest ekstracellulære proteiner ingen dokumenteret bindende partner. Denne forskel skyldes primært de udfordringer forbundet med undersøgelse af de ekstracellulære proteiner, herunder udtryk for funktionelle proteiner, og de svage, lav affinitet, protein interaktioner ofte etableret mellem celle overfladen receptorer. Formålet med denne metode er at beskrive udskrivning af et bibliotek af ekstracellulære proteiner i microarray format til screening af protein-protein interaktioner. For at muliggøre påvisning af svage vekselvirkninger, er en metode baseret på multimerization af forespørgslen protein under undersøgelse beskrevet. Koblet til denne microbead-baseret multimerization tilgang til øget multivalency, giver protein microarray robust påvisning af forbigående protein-protein interaktioner i høj overførselshastighed. Denne metode giver en hurtig og lave prøve forbruger-tilgang til identifikation af nye interaktioner gælder for enhver ekstracellulære protein. Protein microarray udskrivning og screening protokol er beskrevet. Denne teknologi vil være nyttig for efterforskerne søger en robust metode til opdagelsen af protein interaktioner i det ekstracellulære rum.

En skematisk af arbejdsgangen for den ekstracellulære protein microarray teknologi er vist i figur 1. Når microarray slides der indeholder biblioteket ekstracellulære protein er tilgængelige, kan screening af protein af interesse og data analyse afsluttes inden for en dag. Mange fysiologisk relevante interaktioner mellem membran-embedded receptorer er karakteriseret ved meget svag bindende styrker (KD i rækken micromolar). For at forbedre afsl...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Vi præsenterer her, en protokol til skærmen ekstracellulære protein microarrays for identifikation af roman receptor-ligand interaktioner i høj overførselshastighed. Vi beskriver også en metode til at forbedre afsløring af forbigående protein-protein interaktioner ved hjælp af protein-microbead komplekser.

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for proteinproteininteraktioner ved at gøre det muligt at detektionere nye bindende partnere for ekstracellulære proteiner, både i høj gennemløb og med høj følsomhed. Den største fordel ved denne metode er, at med blot et par mikrogram protein, kan du generere hundredvis af dias ved hjælp af mikro array printer. Brug en standardmikroarrayer til slideudskrivning.Dette instrument har en kapacitet på 57 dias pr. løbetur, bruger et printhoved med 48 spottingstifter og kan rumme op til 8.000 pladser pr. dias. Generer arbejdsplader ved hjælp af 384 brøndplader ved 10 mikroliter prøve pr. brønd fra lagerpladerne. Udfør dette trin manuelt, før du udskriver dias ved hjælp af mikroarrayeren.Derefter spot proteiner med quill type spotting stifter på epoxy silan dias på 60% fugtighed for at forhindre dehydrering af protein pletter. Cy3 mærket kvæg serum albumin kan ses i to eksemplarer mellem hver protein prøve til at visualisere array for maske montering. Efter udskrivning fjernes proteinmikroarraets dias fra det befugtede miljø.Brug derefter en ultralydståger til at generere en fin tåge af blokerende løsning, der lægger sig på diasoverfladen. Bloker derefter diasene natten over med 5 % mælk i PBST for at aktivere overfladen. Opbevar dias på minus 20 grader Celsius i 50% glycerol for at forhindre frysning.Interaktioner mellem ekstracellulære proteiner er ofte karakteriseret ved deres lave tilhørsforhold. For at gøre det muligt at detektion af disse interaktioner, ved at øge den bindende aviditet, udviklede vi en multivalent tilgang baseret på fangst af det spurgte protein udtrykt som FC mærkede ekstracellulære domæner på protein A belagt mikroperler. Spin luftfartsselskabet IgG, der er blevet mærket med Cy5 mono reaktive farvestof som beskrevet i tekstprotokollen.For at beregne molære forholdet mellem forespørgslen protein og Cy5 IgG, dividere molekylvægt af forespørgslen protein med molekylvægt af IgG og formere sig med 40 mikrogram per milliliter til at bestemme koncentrationen af Cy5 IgG behov. Når alle nøgletal er blevet bestemt form mikro perle protein kompleks ved at kombinere FC mærkede forespørgsel og Cy5 IgG med proteinet En mikro perler. Ophænget i PBS blandes på en rørretator i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.For at begynde screeningen, varme de forberedte dias ved stuetemperatur, før du lægger på hybridisering station. For at udføre screeningen skal mikroarrayet først vaskes med PBST i et minut for at fjerne resterende glycerol. Der indlæses 200 mikroliter af et milligram per milliliterprotein A i PBS 5%-mælk og inkuberes i 30 minutter for at forhindre ukompleksiseret protein En mikroperler binder sig til FC-mærkede proteiner, der kan være til stede i mikroarrayet.Efter hybridisering station vasker dias med PBST, belastning 200 mikroliter af forespørgslen mikroperle kompleks, i overværelse af en milligram pr milliliter protein A og inkubere i 30 minutter. Efter hybridisering og vask af dias ved hybridisering station, skyl dias med vand og læg dem i individuelle 50 milliliter koniske rør. Tør rørene ved at dreje ved 900 gange G i fem minutter.Endelig scanne dias med en mikro array scanner egnet til at opdage Cy3 og Cy5 fluorescens ved spændende på 532 og 635 nanometer, henholdsvis. Vist her er et repræsentativt billede af en udskrevet slide. Cy3-mærket kvæg serum albumin spots er i grøn.Pletterne blev trykt i to eksemplarer som en kvalitetskontrol af udskrivningsprocessen. Repræsentative resultater af et orphan protein, screenet for identifikation af bindende partnere ved hjælp af ekstracellulære protein mikro array teknologi, vises her. De dublerede røde pletter identificeres som et hit for det screenede forespørgselsprotein.Denne metode, der er beskrevet, er meget alsidig og kan bruges til trykning af en farveskala af protein biblioteker, det være sig specifikke protein familier eller store samlinger af proteiner som vores. Ethvert protein af interesse kan evalueres. Under forsøget på denne procedure er det vigtigt at håndtere dias med omhu og sikre, at de ikke tørrer ud for at forhindre tab af aktivitet af de trykte proteiner.Efter skærmen af et protein af interesse, anbefales det kraftigt at yderligere validere eventuelle hits observeret ved hjælp af ortogonale teknologier, såsom overflade plasmon resonans. Efter sin udvikling, denne teknik har banet vejen for forskere at studere ekstracellulære protein interaktioner hos mennesker.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle Flow strækker Assay gennemførelse for at studere Transport af molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Anvendelse af mikroskala termoforese til måling af protein-lipid interaktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Højtryks NMR-eksperimenter til påvisning af protein lavtliggende kropsbygningstilstande

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Et "dual-addition" calciumfluorescensassay til high-throughput screening af rekombinante G-proteinkoblede receptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimering af flowcytometriske sorteringsparametre til high-throughput isolering og oprensning af små ekstracellulære vesikler

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-throughput proteinkrystallisering via mikrodialyse

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...