Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Wij danken Philamer Calses en Kobe Yuen voor het kritisch lezen van het manuscript. Wij zijn dankbaar Randy Yen voor uitstekende technisch advies.

1. generatie van een bibliotheek van extracellulaire menselijke eiwitten
<ol><li>Een lijst samenstellen van cel oppervlakte receptoren of secreted proteïnen van belang voor de eiwit microarray bibliotheek bouwen. Specifieke proteïne families (bijvoorbeeld de immunoglobuline superfamilie) of eiwitten selectief aangegeven met name cel typen kunnen worden geselecteerd voor de studie.</li>
	<li>Voor oppervlakte cel receptoren, bepalen de extracellulaire domeingrenzen (ECD) door het identificeren van de signaal-peptide en...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

Een aanzienlijk aantal gekoppelde receptoren blijven in het menselijk genoom, en roman interagerende partners blijven voor extracellulaire eiwitten met eerder gekarakteriseerd liganden ontstaan. Vaststelling van de receptor-ligand interacties in mens en modelorganismen is essentieel om te begrijpen van de mechanismen die de cellulaire communicatie tijdens de homeostase, evenals disregulatie leidt tot ziekte dicteren en daarom nieuwe of verbeterde kennis therapeutische opties. Detectie van extracellulaire eiwitinteractie ...

De hier besproken methode beschrijft het afdrukken van een verzameling van extracellulaire eiwitten in een microarray opmaken, gevolgd door een methode voor screening van een doelwit van belang tegen deze bibliotheek. We hebben eiwit multimerization aangewezen als een cruciale stap voor de detectie van interacties gekenmerkt door lage bindende verwantschappen. Om detectie van deze interacties te verbeteren, beschrijven we een protocol op basis van multimerization van de query-proteïne van belang met behulp van microbeads.
Uitgescheiden en cel oppervlak-uitgedrukt eiwitten (collectief genoemd extracellulaire eiwitten) samen met hun interactie partners zijn belangrijke regulatoren van cellulaire communicatie, signalering en interactie met de communicatie. Ze zijn daarom essentieel bij het reguleren van veel fysiologische en pathologische processen. Ongeveer een kwart van het menselijk genoom (≈5, 000 eiwitten) codeert voor extracellulaire eiwitten, die, gezien hun betekenis en toegankelijkheid aan systematisch geleverde drugs, vertegenwoordigen belangrijke doelen voor drug ontwikkeling1. Bijgevolg, extracellulaire eiwitten vertegenwoordigen meer dan 70% van het eiwit doelen met bekende farmacologische werking voor goedgekeurde geneesmiddelen op de markt, bekend als de "druggable Proteoom". Ondanks hun belang en overvloed blijven de extracellulaire eiwit-eiwit-interactienetwerken (ePPI) opmerkelijk ondervertegenwoordigde in de beschikbare databases. Dit is fundamenteel te wijten aan de complexe biochemische aard van de extracellulaire eiwitten, die zich verzet tegen hun karakterisering met behulp van de meeste beschikbare technologieën2. In de eerste plaats zijn membraaneiwitten moeilijk te solubilize, een proces dat vaak hard wassen voorwaarden en detergentia gaat; Ten tweede, extracellulaire eiwitten vaak geen relevante posttranslationele modificaties zoals glycosylatie die zijn afwezig wanneer deze eiwitten worden uitgedrukt in algemeen gebruikte heterologe systemen. Ten slotte, interacties tussen receptoren, zoals co receptoren uitgedrukt op immune cellen, zijn vaak van voorbijgaande aard en gekenmerkt door zeer lage affiniteit (KD in de ~ 1 micrometer tot > 100 μM-bereik). Over het geheel genomen de aard van deze eiwitten en hun bindende partners maken het wijdst gebruikt technologieën, zoals affiniteit zuivering/massaspectrometrie (AP/MS) of gist-twee-hybride, ongeschikt voor detectie van interacties in de extracellulaire ruimte 2 , 3.
In een poging deze technische uitdagingen te overwinnen en de ontdekking van nieuwe interacties voor extracellulaire eiwitten versnellen, hebben we een hoge dekking extracellulaire eiwit microarray4,5. Microarrays bieden het voordeel van het genereren van high-density oppervlakken met kleine hoeveelheden van het monster, en zijn over het algemeen vatbaar voor hoge doorvoer studies. Eiwit microarray gebaseerde studies hebben eerder verstrekte relevante inzichten in eiwitinteractie voor verscheidene modelorganismen, zij het hoofdzakelijk gericht op cytosolische interacties of op specifieke proteïne gezinnen6,7, 8. Daarentegen heeft beperkt gewerkt om te onderzoeken van extracellulaire eiwitinteractie met behulp van deze technologie. We hebben een eiwit microarray methode ontwikkeld om bestudering van ePPIs mogelijk te maken door het bouwen van een uitgebreide en zeer divers bibliotheek van gezuiverde secreted eiwitten en één transmembraan (STM) receptoren uitgedrukt als recombinante extracellulaire domeinen (ECD) tot gesmolten gemeenschappelijke tags voor affiniteit zuivering4. Het succes van de eiwit microarray schermen leunt op de oprichting van een hoge kwaliteit eiwit bibliotheek. Voor de uitdrukking van de bibliotheek en de query eiwit, werden zoogdiercellen of insect cellen bij voorkeur gekozen als heterologe expressiesystemen, om goede toevoeging van posttranslationele modificaties zoals glycosylatie of dissulfide bindingen. SDS-pagina, grootte uitsluiting chromatografie en multi hoek laserlicht verstrooiing zijn technieken die vaak gebruikt om te beoordelen van de kwaliteit van recombinante eiwitten. De eiwit-bibliotheek is dan gespot in epoxysilane dia's en opgeslagen bij-20 ° C voor langdurig gebruik. Eiwit concentraties boven van 0,4 mg/mL worden aanbevolen voor het protocol die hieronder worden beschreven. Daarom uiten van lage eiwitten mogelijk een concentratie stap vóór monster afdrukken en opslag. Een belangrijkste voordeel van deze techniek is echter de kleine hoeveelheid eiwit nodig (50 μg van eiwit is voldoende om uit te voeren > 2.000 schermen), naast de minimale query eiwit consumptie (20-25 μg per duplicaten scherm). Met behulp van het protocol en de apparatuur die hier worden beschreven, en mits de bibliotheken beschikbaar zijn, resultaten voor afzonderlijke query eiwitten binnen één werkdag kunnen worden gegenereerd.
Een grote uitdaging voor het opsporen van eiwitinteractie in de extracellulaire omgeving vloeit voort uit hun typisch zwak of voorbijgaande aard, die zich verzet tegen de identificatie door de meest gebruikte methoden. Uitbreiding van de bindende avidity sterk verbetert de gevoeligheid voor de detectie van zwakke eiwit interacties9,10,11. Gebaseerd op dit principe ontwikkelden we een methode om multimerize de query eiwitten (uitgedrukt als Fc fusion) met behulp van eiwit A beklede kralen4,5. Om te voorkomen dat elke potentiële inactivering van het query-eiwit door willekeurige labeling, wij in plaats daarvan een irrelevant menselijk immunoglobuline met Cy5 label en erbij samen met de query-eiwit moet de EiwitA kralen, waardoor alle artefacten als gevolg van de directe vervoeging van een kleurstof voor de proteïne van belang. Gezien de micromolar verwantschappen van verschillende co receptor paren, verbeteren de multivalent complexen sterk signaal / ruisverhouding, in vergelijking met Fc-fusion query eiwitten gescreend als oplosbare eiwitten4.
Kortom is het doel van dit protocol voor het beschrijven van de voorbereiding van microarray dia's met een bestaande bibliotheek van extracellulaire proteïne voor identificatie van receptor-ligand interacties. We bekijken de stappen voor dia afdrukken, gevolgd door een protocol voor screening van een proteïne van belang tegen de extracellulaire proteïne-bibliotheek. Daarnaast beschrijven we een methode voor de verbeterde detectie van ePPIs gebaseerd op microbeads om hogere avidity van de eiwitten bestudeerde. De extracellulaire eiwit microarray technologie hier beschreven vertegenwoordigt een snelle, krachtige en effectieve benadering van screening en opsporen van roman ePPI met lage vals-positieve ratio's, en door gebruik te maken van enige microgram hoeveelheden van het query-eiwit onder onderzoek. Deze technologie heeft aangewakkerd meerdere studies die relevante inzichten in voorheen onbekende cellulaire functies en signaalroutes hebben gezorgd voor een verscheidenheid van receptoren12,13, met inbegrip van virale immunoregulators14, en kan worden gebruikt om de orphanize elke extracellulaire proteïne van belang.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

Secreted factoren, membraan-gebonden receptoren en hun interactie partners zijn belangrijkste regulatoren van cellulaire communicatie en initiatie van signalering cascades tijdens homeostase en ziekte, en als zodanig vertegenwoordigen voornaamste therapeutische doelen. Ondanks hun relevantie blijven deze interactienetwerken aanzienlijk ondervertegenwoordigde in huidige databanken; Daarom moeten de meest extracellulaire eiwitten geen gedocumenteerde bindende partner. Deze discrepantie is voornamelijk te wijten aan de uitdagingen in verband met de studie van de extracellulaire eiwitten, met inbegrip van expressie van functionele eiwitten, en de zwakke, lage affiniteit, eiwitinteractie vaak tot stand gebracht tussen oppervlakte cel receptoren. Het doel van deze methode is om te beschrijven van het afdrukken van een bibliotheek van extracellulaire eiwitten in een microarray opmaken voor screening van eiwit-eiwitinteractie. Als u wilt inschakelen van detectie van zwakke interacties, wordt een methode gebaseerd op multimerization van het query-eiwit onder studie beschreven. Gekoppeld aan deze benadering van de microbead gebaseerde multimerization voor verhoogde multivalency, maakt de eiwit microarray de robuuste ontdekking van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie in hoge-doorvoer. Deze methode biedt een snelle en lage monster consumeren-benadering voor de identificatie van nieuwe interacties die van toepassing zijn op elke extracellulaire proteïne. Eiwit microarray afdrukken en screening protocol worden beschreven. Deze technologie zal zitten nuttig voor onderzoekers op zoek naar een robuuste methode voor ontdekking eiwitinteractie in de extracellulaire ruimte.

Een schematische voorstelling van de workflow voor de extracellulaire eiwit microarray technologie is afgebeeld in Figuur 1. Zodra de microarray dia's met de extracellulaire proteïne bibliotheek beschikbaar zijn, kan de screening van de proteïne van belang en data analyse binnen één dag worden voltooid. Vele fysiologisch relevante interacties tussen membraan-embedded receptoren worden gekenmerkt door zeer zwak bindende kracht (KD in de micromol...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwit-eiwit interacties door het mogelijk maken van de detectie van nieuwe bindende partners voor extracellulaire eiwitten, zowel in hoge doorvoer en met een hoge gevoeligheid. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat u met slechts een paar microgram eiwit honderden dia's genereren met behulp van de micro-arrayprinter. Gebruik een standaard microarrayer voor diaafdrukken.Dit instrument heeft een capaciteit van 57 dia's per run, maakt gebruik van een printkop met 48 spotpennen en biedt plaats aan maximaal 8.000 plekken per dia. Genereer werkende platen met behulp van 384 putplaten bij 10 microliter monster per put uit de voorraadplaten. Voer deze stap handmatig uit, voordat u diaafdrukken met de microarrayer.Spot vervolgens eiwitten met quilltype die pinnen op epoxy silaneglijbanen met een luchtvochtigheid van 60% spot om uitdroging van de eiwitvlekken te voorkomen. Cy3 gelabeld runder serum albumine kan worden gespot in tweevoud tussen elk eiwit monster om de array te visualiseren voor masker montage. Verwijder na het afdrukken de eiwitmicroarraydia's uit de bevochtigde omgeving.Gebruik vervolgens een ultrasone mister om een fijne mist van blokkerende oplossing te genereren die zich op het diaoppervlak nestelt. Blokkeer vervolgens de dia's 's nachts met 5% melk in PBST om het oppervlak te activeren. Bewaar dia's met min 20 graden Celsius in 50%glycerol om bevriezing te voorkomen.Interacties tussen extracellulaire eiwitten worden vaak gekenmerkt door hun lage affiniteiten. Om de detectie van deze interacties mogelijk te maken, door het verhogen van de bindende avidity, ontwikkelden we een multivalente aanpak op basis van het vastleggen van het gevraagde eiwit uitgedrukt als FC gelabelde extracellulaire domeinen op eiwit A gecoate micro kralen. Spin de drager IgG, die is gelabeld met Cy5 mono reactieve kleurstof zoals beschreven in de tekst protocol.Om de molaire verhouding van het query-eiwit en Cy5 IgG te berekenen, verdeelt u het moleculaire gewicht van het queryeiwit door het moleculaire gewicht van de IgG en vermenigvuldigt u met 40 microgram per milliliter om de concentratie van Cy5 IgG te bepalen. Zodra alle verhoudingen zijn bepaald vormen de micro kraal eiwit complex door het combineren van de FC gelabelde query en de Cy5 IgG met het eiwit A micro kralen. Meng de vering in PBS op een buis rotator gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, beschermd tegen licht.Om te beginnen met de screening, verwarm de voorbereide glijbanen bij kamertemperatuur voordat u op het hybridisatiestation laadt. Om de screening uit te voeren, eerst wassen van de micro-array met PBST voor een minuut om resterende glycerol te verwijderen. Laad 200 microliter van één milligram per milliliter eiwit A in PBS 5% melk en incubbate gedurende 30 minuten om te voorkomen dat onvercomplexe eiwitten Een microkraal bindt aan FC-gelabelde eiwitten die in de microarray aanwezig kunnen zijn.Na de hybridisatie station wast de dia's met PBST, belasting 200 microliter van de query micro kraal complex, in aanwezigheid van een milligram per milliliter eiwit A en incubaat gedurende 30 minuten. Na hybridisatie en het wassen van de glijbanen door het hybridisatiestation, spoel glijbanen met water en plaats ze in individuele 50 milliliter conische buizen. Droog de buizen door vijf minuten op 900 keer G te draaien.Ten slotte, scan de dia's met een micro-array scanner geschikt om Cy3 en Cy5 fluorescentie te detecteren door spannend op 532 en 635 nanometer, respectievelijk. Hier wordt een representatieve afbeelding van een afgedrukte dia weergegeven. De Cy3 gelabelde runderserum albumin spots zijn in het groen.De spots werden in tweevoud afgedrukt als kwaliteitscontrole van het drukproces. Representatieve resultaten van een weeseiwit, gescreend op identificatie van bindende partners met behulp van de extracellulaire eiwitmicroarraytechnologie, worden hier getoond. De dubbele rode vlekken worden geïdentificeerd als een hit voor de gescreende query eiwit.Deze methode die wordt beschreven is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor het afdrukken van een gamma van eiwitbibliotheken, of het nu gaat om specifieke eiwitfamilies of grote compilaties van eiwitten zoals het onze. Elk eiwit van belang kan worden geëvalueerd. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om de dia's met zorg te behandelen en ervoor te zorgen dat ze niet uitdrogen om het verlies van activiteit van de gedrukte eiwitten te voorkomen.Na het scherm van een eiwit van belang, is het sterk aangeraden om eventuele hits waargenomen door het gebruik van orthogonale technologieën, zoals oppervlakteplasmon resonantie verder te valideren. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om extracellulaire eiwitinteracties bij de mens te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Hogedruk NMR-experimenten voor het detecteren van eiwitarme conformatietoestanden

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimalisatie van flowcytometrische sorteerparameters voor isolatie met hoge doorvoer en zuivering van kleine extracellulaire blaasjes

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Eiwitkristallisatie via microdialyse

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...