Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Nous remercions Philamer Calses et Kobe Yuen pour la lecture critique du manuscrit. Nous sommes reconnaissants à Randy yens pour les excellents conseils techniques.

1. génération d’une bibliothèque d’extracellulaires protéines humaines
<ol><li>Dresser une liste des récepteurs de surface cellulaire ou des protéines sécrétées d’intérêt pour générer la bibliothèque de microarray de protéine. Familles de protéines spécifiques (par exemple, la superfamille des immunoglobulines) ou protéines sélectivement exprimé en particulier cellules types peuvent être sélectionnés pour l’étude.</li>
	<li>Pour les récepteurs de surface cellulaire, déterminer les limi...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. 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C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

Un nombre important de récepteurs orphelins demeure dans le génome humain, et nouveaux partenaires interdépendants continuent d’émerger des protéines extracellulaires avec des ligands précédemment caractérisées. Définir les interactions de récepteur-ligand dans l’homme et les organismes modèles est essentielle pour comprendre les mécanismes qui régissent la communication cellulaire lors de l’homéostasie, comme dérèglement conduisant à la maladie et par conséquent informer nouveaux ou améliorés ...

La méthode examinée ici décrit l’impression d’une collection de protéines extracellulaires dans un format « microarray », suivie d’une méthode de dépistage d’une cible d’intérêt contre cette bibliothèque. Nous avons identifié des protéines multimerization comme une étape cruciale pour la détection des interactions caractérisées par affinités de liaison faible. Pour améliorer la détection de ces interactions, les auteurs décrivent un protocole basé sur multimerization de la protéine de requête d’intérêt à l’aide de microbilles.
Sécrétée et cell surface protéines exprimées (collectivement appelées protéines extracellulaires) ainsi que leurs partenaires d’interactions sont des régulateurs clés de communication cellulaire, la signalisation et l’interaction avec le microenvironnement. Ils sont, par conséquent, essentiels dans la régulation de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Environ un quart du génome humain (≈5, 000 protéines) codant pour des protéines extracellulaires, qui, compte tenu de leur importance et leur accessibilité aux médicaments systématiquement livrées, représentent des cibles clés pour drogues développement1. En conséquence, les protéines extracellulaires représentent plus de 70 % des cibles protéiques avec action pharmacologique connue pour des médicaments homologués sur le marché, connu comme le « proteome thérapeutiques ». Malgré leur importance et leur abondance, les réseaux d’interaction (ePPI) extracellulaire protéines restent remarquablement sous-représentées dans les bases de données disponibles. Il s’agit fondamentalement en raison de la complexité biochimique des protéines extracellulaires, qui s’oppose à leur caractérisation à l’aide de technologies plus disponible2. Tout d’abord, les protéines membranaires sont difficiles à solubiliser, un processus qui comporte souvent des conditions de lavage dure et détergents ; Deuxièmement, protéines extracellulaires manquent souvent des modifications post-traductionnelles telles que glycosylation qui sont absents lorsque ces protéines sont exprimées en couramment utilisées systèmes hétérologues. Enfin, les interactions entre les récepteurs comme corécepteurs exprimées sur les cellules immunitaires, sont souvent transitoires et caractérisé par une très faible affinité (KD dans le ~ 1 μM à > 100 gamme μM). Au total, la nature de ces protéines et leur liaison partenaires rendent plus largement utilisé des technologies, telles que l’affinité purification/spectrométrie de masse (AP/MS) ou levure-double-hybride, impropre à la détection des interactions dans l’espace extracellulaire 2 , 3.
Dans le but de relever ces défis techniques et d’accélérer la découverte de nouvelles interactions des protéines extracellulaires, nous avons développé une couverture élevée protéines extracellulaires microarray4,5. Microarrays offrent l’avantage de générer des surfaces à haute densité avec de petites quantités d’échantillon et généralement se prêtent à des études de haut débit. Études de puces de protéine fournis précédemment pertinentes aperçus des interactions de protéine pour plusieurs organismes modèles, quoique se concentrant principalement sur les interactions cytosoliques ou protéine spécifique familles6,7, 8. En revanche, travail limité a été fait pour étudier les interactions de protéine extracellulaire à l’aide de cette technologie. Nous avons développé une méthode de microarray de protéine pour permettre des études d’ePPIs en construisant une bibliothèque complète et diversifiée de protéines sécrétées purifiées et unique transmembranaire (STM) récepteurs exprimés comme recombinants domaines extracellulaires (DPE), fusionnées à balises communes pour affinité purification4. Le succès des écrans microarray protéine dépend fortement de la mise en place d’une bibliothèque de protéine de haute qualité. Pour l’expression de la protéine de la bibliothèque et la requête, les cellules de mammifères ou des cellules d’insecte préférentiellement apparaissaient comme des systèmes d’expression hétérologue, afin d’assurer le bon ajout de modifications post-traductionnelles telles que liaisons disulfure de glycosylation. SDS-PAGE, chromatographie d’exclusion et de diffusion de la lumière laser multi-angle sont des techniques couramment utilisées pour évaluer la qualité des protéines recombinantes. La bibliothèque de la protéine est ensuite repérée sur des diapositives epoxysilane et conservée à-20 ° C pour une utilisation à long terme. Les concentrations de protéine au-dessus de 0,4 mg/mL sont recommandées pour le protocole décrit ci-dessous. Par conséquent, faible exprimant des protéines peuvent exiger une étape de concentration avant l’impression de l’échantillon et le stockage. Néanmoins, un principal avantage de cette technique est le faible volume de protéine nécessaire (50 μg de protéines est suffisante pour exécuter > 2 000 écrans), aux côtés de la consommation de protéines de requête minimale (20 à 25 μg par écran de doublons). Utilisant le protocole et les équipements décrits ici, et autant de bibliothèques sont disponibles, des résultats pour les protéines de requêtes individuelles peuvent être générés un jour ouvrable.
Un défi majeur dans la détection des interactions de protéine dans l’environnement extracellulaire découle de leur caractère typiquement faible ou transitoire, qui s’oppose à une identification par des méthodologies plus couramment utilisés. Accroître l’avidité de liaison grandement améliore la sensibilité pour la détection des protéines faibles interactions9,10,11. Basé sur ce principe que nous avons développé une méthode pour multimerize les protéines de la requête (exprimées en fusion Fc) à l’aide de protéine A-enduit perles4,5. Pour éviter toute éventuelle inactivation de la protéine de la requête par marquage aléatoire, nous plutôt étiqueter une immunoglobuline humaine hors de propos G avec Cy5 et ajoutez-le ainsi que de la protéine de requête pour les billes de protéine A, éliminant ainsi tous les artefacts en raison de la conjugaison directe d’un teindre à la protéine d’intérêt. Étant donné les affinités micromolaires de plusieurs paires de corécepteur, les complexes multivalents augmentent considérablement le rapport signal sur bruit, par rapport aux protéines de requête Fc-fusion projetés en protéines solubles4.
En résumé, le but du présent protocole est de décrire la préparation de lames microarray contenant une bibliothèque de protéines extracellulaires préexistant pour l’identification des interactions de récepteur-ligand. Nous passons en revue les étapes de la diapositive, impression, suivi d’un protocole de dépistage d’une protéine d’intérêt à la bibliothèque de protéines extracellulaires. De plus, on décrit une méthode pour la détection améliorée d’ePPIs issu des microbilles pour atteindre une avidité accrue de la protéine étudiée. La technologie de microarray de protéine extracellulaire décrite ici représente une approche rapide, robuste et efficace pour le dépistage et détection ePPI roman avec faible de faux positifs et en utilisant seulement microgramme par quantités de la protéine de la requête en vertu de enquête. Cette technologie a alimenté de nombreuses études qui ont fourni des renseignements pertinents sur jusque-là inconnues des fonctions cellulaires et voies de signalisation pour une variété de récepteurs12,13, dont14d’immunoregulators virale, et peut être utilisé pour désactiver orphanize toute protéine extracellulaire d’intérêt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

Facteurs sécrétés, attaché à la membrane des récepteurs et leurs partenaires d’interactions sont les principaux régulateurs de la communication cellulaire et l’initiation des cascades de signalisation au cours de l’homéostasie et la maladie et ainsi représentent des cibles thérapeutiques. Malgré leur pertinence, ces réseaux d’interactions reste nettement sous-représentées dans des bases de données courantes ; par conséquent, plus les protéines extracellulaires n’ont aucun partenaire de liaison documentée. Cet écart est principalement en raison de relever les défis associés à l’étude des protéines extracellulaires, notamment de l’expression des protéines fonctionnelles et l’affinité faible, faible, interactions protéine souvent établies entre les récepteurs de surface cellulaire. Le but de cette méthode consiste à décrire l’impression d’une bibliothèque de protéines extracellulaires dans un format « microarray » pour le dépistage des interactions protéine-protéine. Pour activer la détection des interactions faibles, on décrit une méthode basée sur la multimerization de la protéine de requête à l’étude. Couplé à cette approche axée sur les faisant multimerization de MULTIVALENCE accrue, le microarray de protéine permet une détection robuste d’interactions protéine-protéine transitoire en haut débit. Cette méthode offre une échantillon rapide et faible consommation-approche pour l’identification de nouvelles interactions applicables à n’importe quelle protéine extracellulaire. Impression de microarray de protéine et le protocole de dépistage sont décrits. Cette technologie sera utile pour les chercheurs qui cherchent une méthode robuste à la découverte des interactions de protéine dans l’espace extracellulaire.

Un schéma du flux de travail pour la technologie des microréseaux protéine extracellulaire est illustré à la Figure 1. Une fois les lames microarray contenant la bibliothèque de protéines extracellulaires sont disponibles, la projection de la protéine d’intérêt et des données d’analyse peut être complétée en un jour. Nombreuses interactions physiologiquement pertinentes entre les récepteurs membranaires incorporées sont caractérisées par...

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Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Nous présentons ici un protocole à l’écran une protéine extracellulaire microarrays pour l’identification des interactions ligand-récepteur roman en haut débit. On décrit également une méthode pour améliorer la détection des interactions protéine-protéine transitoires en utilisant des complexes protéine-faisant.

Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions protéiques en permettant la détection de nouveaux partenaires contraignants pour les protéines extracellulaires, à la fois à haut débit et avec une sensibilité élevée. Le principal avantage de cette méthode est que, avec seulement quelques microgrammes de protéines, vous pouvez générer des centaines de diapositives à l’aide de l’imprimante micro tableau. Utilisez un micro-tableauur standard pour l’impression de diapositives.Cet instrument a une capacité de 57 diapositives par course, utilise une tête d’impression tenant 48 broches de repérage, et peut accueillir jusqu’à 8000 taches par diapositive. Produire des plaques de travail à l’aide de 384 plaques de puits à 10 microlitres d’échantillon par puits à partir des plaques de stock. Effectuez cette étape manuellement, avant l’impression de diapositives à l’aide du micro arrayer.Repérage ensuite des protéines avec des épingles de repérage de type piquant sur des glissières de silane époxy à 60% d’humidité pour empêcher la déshydratation des taches protéiques. L’albumine de sérum bovin étiquetée Cy3 peut être repérée en double entre chaque échantillon de protéines pour visualiser le tableau pour l’ajustement du masque. Après l’impression, retirez les diapositives de micro-tableau protéique de l’environnement humidifié.Ensuite, utilisez un brumère ultrasonique pour générer une fine brume de solution de blocage qui s’installe sur la surface de la glissière. Ensuite, bloquez les glissières pendant la nuit avec 5% de lait dans PBST pour activer la surface. Conservez les glissières à moins 20 degrés Celsius à 50 % de glycérol pour éviter le gel.Les interactions entre les protéines extracellulaires sont souvent caractérisées par leurs faibles affinités. Pour permettre la détection de ces interactions, en augmentant l’avidité contraignante, nous avons développé une approche multivalente basée sur la capture de la protéine interrogée exprimée sous forme de domaines extracellulaires marqués FC sur les microbilles enduites de protéines A. Faites tourner le transporteur IgG, qui a été étiqueté avec du colorant mono réactif Cy5 tel que décrit dans le protocole de texte.Pour calculer le rapport molaire de la protéine de requête et de l’IgG Cy5, divisez le poids moléculaire de la protéine de requête par le poids moléculaire de l’IgG et multipliez par 40 microgrammes par millilitre pour déterminer la concentration de Cy5 IgG nécessaire. Une fois que tous les ratios ont été déterminés forment le complexe de protéines de perle micro en combinant la requête marquée FC et l’IgG Cy5 avec la protéine A micro perles. Mélanger la suspension en PBS sur un rotateur à tube pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.Pour commencer le criblage, réchauffez les glissières préparées à température ambiante avant de les charger sur la station d’hybridation. Pour effectuer le criblage, lavez d’abord le micro-tableau avec PBST pendant une minute pour enlever le glycérol résiduel. Chargez 200 microlitres d’un milligramme par protéine millilitre A dans le lait PBS 5% et incubez pendant 30 minutes pour empêcher les microbilles de protéines A non complexées de se lier aux protéines étiquetées FC qui peuvent être présentes dans le micro-tableau.Après que la station d’hybridation lave les glissières avec PBST, chargez 200 microlitres du complexe de micro perles de requête, en présence d’un milligramme par millilitre de protéine A et incubez pendant 30 minutes. Après hybridation et lavage des glissières par la station d’hybridation, rincer les toboggans à l’eau et les placer dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres. Séchez les tubes en tournant à 900 fois G pendant cinq minutes.Enfin, numérisez les diapositives à l’aide d’un scanner micro-réseau approprié pour détecter la fluorescence Cy3 et Cy5 en excitant à 532 et 635 nanomètres, respectivement. Il est indiqué ici une image représentative d’une diapositive imprimée. Les taches d’albumine de sérum bovin étiquetées Cy3 sont en vert.Les spots ont été imprimés en double comme un contrôle de qualité du processus d’impression. Les résultats représentatifs d’une protéine orpheline, sélectionnés pour l’identification des partenaires liants à l’aide de la technologie de micro-réseau de protéines extracellulaires, sont présentés ici. Les taches rouges en double sont identifiées comme un succès pour la protéine de requête filtrée.Cette méthode qui est décrite est très polyvalente et peut être utilisée pour l’impression d’une gamme de bibliothèques de protéines, qu’il s’agit de familles de protéines spécifiques ou de grandes compilations de protéines comme la nôtre. Toute protéine d’intérêt peut être évaluée. Tout en essayant cette procédure, il est important de manipuler les diapositives avec soin et de s’assurer qu’elles ne se dessèchent pas afin d’éviter la perte d’activité des protéines imprimées.Après l’écran d’une protéine d’intérêt, il est fortement conseillé de valider davantage les coups observés en utilisant des technologies orthogonales, telles que la résonance plasmon de surface. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier les interactions protéiques extracellulaires chez l’homme.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Recherche

Biochimie

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Une seule molécule Simple, robuste et haut débit débit étirement test mise en place pour étudier le Transport de molécules le long de l’ADN

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

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