Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

हम गंभीर पांडुलिपि पढ़ने के लिए Philamer cals और कोबे यूएन धंयवाद । हम उत्कृष्ट तकनीकी सलाह के लिए रेंडी येन के लिए आभारी हैं ।

1. Extracellular मानव प्रोटीन की एक पुस्तकालय की पीढ़ी
<ol><li>सेल सतह रिसेप्टर्स या ब्याज की गुप्त प्रोटीन की एक सूची के लिए प्रोटीन microarray पुस्तकालय का निर्माण संकलित करें । विशिष्ट प्रोटीन परिवारों (उदाहरण के लिए, imm...

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	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. 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C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

अनाथ रिसेप्टर्स की एक महत्वपूर्ण संख्या मानव जीनोम में रहते हैं, और उपंयास बातचीत भागीदारों के लिए पहले से लाइगैंडों विशेषता के साथ extracellular प्रोटीन के लिए उभरने के लिए जारी है । मानव और मॉडल जीवों में रिस...

इस विधि की समीक्षा यहां एक microarray प्रारूप में extracellular प्रोटीन का एक संग्रह के मुद्रण का वर्णन करता है, इस पुस्तकालय के खिलाफ ब्याज की एक लक्ष्य की स्क्रीनिंग के लिए एक विधि द्वारा पीछा किया । हम कम बाध्यकारी समानताएं द्वारा विशेषता बातचीत का पता लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में प्रोटीन multimerization की पहचान की है । इन बातचीत का पता लगाने को बढ़ाने के लिए, हम एक microbeads का उपयोग ब्याज की क्वेरी प्रोटीन के multimerization के आधार पर प्रोटोकॉल का वर्णन ।
गुप्त और कोशिका की सतह-व्यक्त प्रोटीन (सामूहिक रूप से extracellular प्रोटीन) के साथ साथ उनके बातचीत भागीदारों सेलुलर संचार के प्रमुख नियामकों हैं, संकेतन और microenvironment के साथ बातचीत । वे कर रहे हैं, इसलिए, कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को विनियमित करने में आवश्यक. मानव जीनोम के लगभग एक चौथाई (≈ ५,००० प्रोटीन) extracellular प्रोटीन है, जो, उनके महत्व और व्यवस्थित दवाओं के लिए पहुंच दिया, दवा के विकास के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करने के लिए encodes1। नतीजतन, extracellular प्रोटीन बाजार पर अनुमोदित दवाओं के लिए ज्ञात औषधीय कार्रवाई के साथ प्रोटीन लक्ष्य के ७०% से अधिक प्रतिनिधित्व करते हैं, "druggable proteome" के रूप में जाना जाता है । उनके महत्व और बहुतायत के बावजूद, extracellular प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन (एपपि ने) नेटवर्क उपलब्ध डेटाबेस में उल्लेखनीय रूप से प्रतिनिधित्व करते रहते हैं । यह मौलिक extracellular प्रोटीन है, जो सबसे उपलब्ध प्रौद्योगिकियों2का उपयोग कर अपने लक्षण वर्णन precludes के जटिल जैव रासायनिक प्रकृति के कारण है । सबसे पहले, झिल्ली प्रोटीन solubilize, एक प्रक्रिया है कि अक्सर कठोर धोने की स्थिति और डिटर्जेंट शामिल करने के लिए मुश्किल है; दूसरे, extracellular प्रोटीन अक्सर ऐसे glycosylation के रूप में प्रासंगिक पोस्ट अनुवाद संशोधनों की कमी है कि अनुपस्थित रहे है जब इन प्रोटीन आमतौर पर इस्तेमाल किया heterologous प्रणालियों में व्यक्त कर रहे हैं । अंत में, रिसेप्टर्स के बीच बातचीत, जैसे सह के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर व्यक्त रिसेप्टर्स, अक्सर क्षणिक होते हैं और बहुत कम समानताएं द्वारा विशेषता (KD में ~ 1 माइक्रोन के लिए > 100 माइक्रोन रेंज). कुल मिलाकर, इन प्रोटीन और उनके बाध्यकारी भागीदारों की प्रकृति इस तरह के संबंध शुद्धि के रूप में सबसे व्यापक रूप से उपयोग प्रौद्योगिकियों, रेंडर/मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी/MS) या खमीर-दो-संकर, extracellular अंतरिक्ष में बातचीत का पता लगाने के लिए अनुपयुक्त 2 , 3.
इन तकनीकी चुनौतियों को दूर करने और extracellular प्रोटीन के लिए उपंयास बातचीत की खोज में तेजी लाने के प्रयास में, हम एक उच्च कवरेज extracellular प्रोटीन microarray4,5विकसित किया है । Microarrays नमूना की छोटी मात्रा के साथ उच्च घनत्व सतहों पैदा करने का लाभ प्रदान करते हैं, और आम तौर पर उच्च प्रवाह अध्ययन के लिए उत्तरदायी हैं । प्रोटीन microarray आधारित अध्ययन पहले कई मॉडल जीवों के लिए प्रोटीन बातचीत में प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है, हालांकि मुख्य रूप से cytosolic बातचीत या विशिष्ट प्रोटीन परिवारों पर ध्यान केंद्रित6,7, 8. इसके विपरीत इस तकनीक का इस्तेमाल करते हुए extracellular प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए सीमित काम किया गया है । हम एक प्रोटीन microarray विधि विकसित की है एक व्यापक और अत्यधिक विविध पुस्तकालय के निर्माण द्वारा ePPIs के अध्ययन को सक्षम शुद्ध स्रावित प्रोटीन और एकल transmembrane (STM) रिसेप्टर्स रिकॉमबिनेंट extracellular डोमेन (ECD) के रूप में व्यक्त करने के लिए जुड़े समानता शुद्धि के लिए आम टैग4. प्रोटीन microarray स्क्रीन की सफलता एक उच्च गुणवत्ता प्रोटीन पुस्तकालय की स्थापना पर भारी निर्भर करता है । पुस्तकालय और क्वेरी प्रोटीन दोनों की अभिव्यक्ति के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं या कीट कोशिकाओं को तरजीही रूप से heterologous एक्सप्रेशन सिस्टम के रूप में चुना गया था, glycosylation या disulphide बांड जैसे पोस्ट-शोधों संशोधनों के उचित अतिरिक्त सुनिश्चित करने के लिए. एसडीएस-पृष्ठ, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी और बहु कोण लेजर प्रकाश कैटरिंग तकनीक सामांयतः रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रोटीन पुस्तकालय तो epoxysilane स्लाइड पर देखा जाता है और लंबी अवधि के उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । ०.४ मिलीग्राम/एमएल के ऊपर प्रोटीन सांद्रता नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के लिए सिफारिश की है । इसलिए, कम व्यक्त प्रोटीन एक एकाग्रता कदम से पहले नमूना मुद्रण और भंडारण की आवश्यकता हो सकती है । फिर भी, इस तकनीक का एक मुख्य लाभ की आवश्यकता प्रोटीन की छोटी मात्रा है (५० प्रोटीन की μg > 2000 स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है), न्यूनतम क्वेरी प्रोटीन की खपत के साथ (20-25 μg प्रति डुप्लिकेट स्क्रीन). प्रोटोकॉल और उपकरणों का उपयोग यहां वर्णित है, और प्रदान की पुस्तकालयों उपलब्ध हैं, व्यक्तिगत क्वेरी प्रोटीन के लिए परिणाम एक कार्य दिवस के भीतर उत्पंन किया जा सकता है ।
extracellular वातावरण में प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में एक प्रमुख चुनौती उनके विशिष्ट रूप से कमजोर या क्षणिक प्रकृति है, जो सबसे अधिक इस्तेमाल के तरीके से precludes पहचान से उठता है । बाध्यकारी avid बहुत कमजोर प्रोटीन बातचीत9,10,11का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि. इस सिद्धांत के आधार पर हम क्वेरी प्रोटीन multimerize करने के लिए एक विधि विकसित (एफसी फ्यूजन के रूप में व्यक्त) प्रोटीन a-लेपित मोती4,5का उपयोग कर । यादृच्छिक लेबलिंग द्वारा क्वेरी प्रोटीन की किसी भी संभावित निष्क्रियता से बचने के लिए, हम बजाय Cy5 के साथ एक अप्रासंगिक मानव immunoglobulin जी लेबल और यह प्रोटीन एक मोतियों के लिए क्वेरी प्रोटीन के साथ जोड़ने के लिए, इस प्रकार के प्रत्यक्ष विकार के कारण किसी भी कलाकृतियों को नष्ट करने प् याज के प्रोटीन को डाई करें । कई सह रिसेप्टर जोड़े के micromolar समानताएं को देखते हुए, multivalent परिसरों बहुत शोर अनुपात करने के लिए संकेत को बढ़ाने, एफसी-फ्यूजन क्वेरी प्रोटीन घुलनशील प्रोटीन के रूप में जांच की तुलना में4.
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य रिसेप्टर-ligand बातचीत की पहचान के लिए एक पूर्व मौजूदा extracellular प्रोटीन पुस्तकालय युक्त microarray स्लाइड की तैयारी का वर्णन करने के लिए है. हम स्लाइड मुद्रण, extracellular प्रोटीन पुस्तकालय के खिलाफ ब्याज की एक प्रोटीन की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल के बाद के लिए चरणों की समीक्षा करें । इसके अलावा, हम अध्ययन के तहत प्रोटीन की वृद्धि की शौकीनता को प्राप्त करने के लिए microbeads के आधार पर ePPIs के बढ़ाया पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन । extracellular प्रोटीन microarray प्रौद्योगिकी यहां वर्णित एक तेज, मजबूत और प्रभावी जांच और कम झूठी सकारात्मक अनुपात के साथ उपंयास एपपि ने का पता लगाने के लिए दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, और क्वेरी प्रोटीन के तहत केवल माइक्रोग्राम मात्रा का उपयोग करके जांच. इस प्रौद्योगिकी के कई अध्ययनों है कि पहले से अज्ञात सेलुलर कार्यों में प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है ईंधन है और12,13वायरल immunoregulators14सहित रिसेप्टर्स की एक किस्म के लिए संकेत रास्ते, और de-orphanize ब्याज की किसी भी extracellular प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

स्रावित कारकों, झिल्ली सीमित रिसेप्टर्स, और उनके बातचीत भागीदारों सेलुलर संचार और homeostasis और रोग के दौरान कैस्केडिंग संकेत की दीक्षा के मुख्य नियामकों हैं, और इस तरह के रूप में प्रधानमंत्री चिकित्सीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं. उनकी प्रासंगिकता के बावजूद, इन संपर्क नेटवर्क मौजूदा डेटाबेस में काफी प्रतिनिधित्व रह; इसलिए, सबसे extracellular प्रोटीन कोई प्रलेखित बाध्यकारी भागीदार है । यह विसंगति मुख्य रूप से कार्यात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति सहित extracellular प्रोटीन के अध्ययन के साथ जुड़े चुनौतियों के कारण है, और कमजोर, कम अपनत्व, प्रोटीन बातचीत अक्सर सेल सतह रिसेप्टर्स के बीच स्थापित. इस पद्धति का उद्देश्य प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की स्क्रीनिंग के लिए microarray स्वरूप में extracellular प्रोटीन्स की एक लाइब्रेरी की छपाई का वर्णन करना है. कमजोर बातचीत का पता लगाने को सक्षम करने के लिए, एक अध्ययन के तहत क्वेरी प्रोटीन के multimerization पर आधारित विधि वर्णित है । वृद्धि हुई multivalency के लिए इस microbead आधारित multimerization दृष्टिकोण के लिए युग्मित, प्रोटीन microarray उच्च प्रवाह में क्षणिक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का मजबूत पता लगाने की अनुमति देता है । इस विधि किसी भी extracellular प्रोटीन के लिए लागू नए बातचीत की पहचान के लिए एक तेजी से और कम नमूना लेने-दृष्टिकोण प्रदान करता है. प्रोटीन microarray प्रिंटिंग और स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल बताए गए हैं । यह तकनीक extracellular अंतरिक्ष में प्रोटीन इंटरैक्शन की खोज के लिए एक दमदार विधि की मांग करने वाले जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होगी ।

extracellular प्रोटीन microarray प्रौद्योगिकी के लिए कार्यप्रवाह का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है । एक बार extracellular प्रोटीन पुस्तकालय युक्त microarray स्लाइड उपलब्ध हैं, ब्याज और डेटा विश्लेषण ?...

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Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

यहां, हम उच्च प्रवाह में उपंयास रिसेप्टर ligand बातचीत की पहचान के लिए स्क्रीन extracellular प्रोटीन microarrays के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम भी प्रोटीन-microbead परिसरों का उपयोग करके क्षणिक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का पता लगाने को बढ़ाने के लिए एक विधि का वर्णन ।

Extracellular प्रोटीन Microarray कम संबध रिसेप्टर का उच्च प्रवाह का पता लगाने के लिए प्रौद्योगिकी-Ligand बातचीत

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

यह विधि प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जिससे अतिरिक्त प्रोटीन के लिए उपन्यास बाध्यकारी भागीदारों का पता लगाया जा सकता है, दोनों उच्च थ्रूपुट में और उच्च संवेदनशीलता के साथ। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि, प्रोटीन के कुछ ही माइक्रोग्राम के साथ, आप माइक्रो सरणी प्रिंटर का उपयोग करके सैकड़ों स्लाइड उत्पन्न कर सकते हैं। स्लाइड प्रिंटिंग के लिए एक मानक माइक्रो ऐरेर का उपयोग करें।इस उपकरण की क्षमता प्रति रन 57 स्लाइड है, एक प्रिंट हेड होल्डिंग 48 स्पॉटिंग पिन का उपयोग करता है, और प्रति स्लाइड 8, 000 स्पॉट तक समायोजित कर सकता है। स्टॉक प्लेटों से प्रति अच्छी तरह से नमूना के 10 माइक्रोलीटर पर 384 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करके काम करने वाली प्लेटें उत्पन्न करें। माइक्रो ऐरेयर का उपयोग करके स्लाइड प्रिंटिंग से पहले इस चरण को मैन्युअल रूप से करें।फिर प्रोटीन स्पॉट के निर्जलीकरण को रोकने के लिए 60% आर्द्रता पर एपॉक्सी सिलेन स्लाइड पर कलम प्रकार खोलना पिन के साथ प्रोटीन हाजिर करें। Cy3 लेबल गोजातीय सीरम एल्बुमिन मुखौटा फिटिंग के लिए सरणी कल्पना करने के लिए प्रत्येक प्रोटीन नमूने के बीच डुप्लिकेट में देखा जा सकता है । मुद्रण के बाद, आर्द्र वातावरण से प्रोटीन माइक्रो सरणी स्लाइड हटा दें।इसके बाद, स्लाइड सतह पर सुलझेगी कि समाधान अवरुद्ध की एक ठीक धुंध उत्पन्न करने के लिए एक अल्ट्रासोनिक फॉगर का उपयोग करें। फिर, सतह को निष्क्रिय करने के लिए पीबीएएसटी में 5% दूध के साथ रात भर स्लाइड ब्लॉक करें। ठंड को रोकने के लिए 50% ग्लाइसरोल में माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर करें।एक्सट्रासेलुलर प्रोटीन के बीच इंटरैक्शन अक्सर उनकी कम आत्मीयता की विशेषता होती है। इन बातचीत का पता लगाने को सक्षम करने के लिए, बाध्यकारी उत्साह को बढ़ाकर, हमने व्यक्त किए गए प्रश्नों वाले प्रोटीन को पकड़ने के आधार पर एक बहुसंयोजक दृष्टिकोण विकसित किया क्योंकि एफसी ने प्रोटीन ए कोटेड माइक्रो मोतियों पर बाह्य कोल्युलर डोमेन को टैग किया था। वाहक आईजीजी को स्पिन करें, जिसे टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित Cy5 मोनो रिएक्टिव डाई के साथ लेबल किया गया है।क्वेरी प्रोटीन और Cy5 IgG के मोलर अनुपात की गणना करने के लिए, आईजीजी के आणविक वजन से क्वेरी प्रोटीन के आणविक वजन को विभाजित करें और आवश्यक Cy5 IgG की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 40 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर से गुणा करें। एक बार सभी अनुपात निर्धारित किया गया है एफसी टैग क्वेरी और प्रोटीन एक माइक्रो मोती के साथ Cy5 IgG के संयोजन से माइक्रो मनका प्रोटीन परिसर के रूप में । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर PBS में निलंबन मिलाएं, प्रकाश से संरक्षित।स्क्रीनिंग शुरू करने के लिए, संकरण स्टेशन पर लोड होने से पहले कमरे के तापमान पर तैयार स्लाइड गर्म करें। स्क्रीनिंग करने के लिए, अवशिष्ट ग्लिसरोल को हटाने के लिए पहले एक मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ माइक्रो सरणी धोएं। पीबीएस 5% दूध में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर प्रोटीन ए के 200 माइक्रोलीटर लोड करें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि अनकपूर्ध प्रोटीन को रोका जा सके एक माइक्रो मोतियों को एफसी टैग किए गए प्रोटीन को बाध्यकारी से रोका जा सके जो माइक्रो सरणी में मौजूद हो सकते हैं।संकरण स्टेशन के बाद पीबीएसटी के साथ स्लाइड धोता है, क्वेरी माइक्रो मनका परिसर के २०० माइक्रोलीटर लोड, एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर प्रोटीन ए की उपस्थिति में और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट । संकरण स्टेशन द्वारा स्लाइडों के संकरण और धोने के बाद, पानी के साथ स्लाइड कुल्ला और उन्हें व्यक्तिगत 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में जगह है। ट्यूबों को पांच मिनट के लिए 900 गुना जी पर घूमकर सुखा लें।अंत में, क्रमशः 532 और 635 नैनोमीटर पर रोमांचक द्वारा Cy3 और Cy5 फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए उपयुक्त माइक्रो सरणी स्कैनर के साथ स्लाइड स्कैन करें। यहां दिखाया गया है एक मुद्रित स्लाइड की एक प्रतिनिधि छवि है । Cy3 लेबल गोजातीय सीरम एल्बुमिन स्पॉट हरे रंग में हैं।प्रिंटिंग प्रक्रिया के गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में स्थानों को डुप्लिकेट में मुद्रित किया गया था। एक अनाथ प्रोटीन के प्रतिनिधि परिणाम, बाह्राश प्रोटीन माइक्रो सरणी प्रौद्योगिकी का उपयोग कर बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए जांच की, यहां दिखाया गया है । डुप्लीकेट लाल धब्बे जांच क्वेरी प्रोटीन के लिए एक हिट के रूप में पहचाने जाते हैं ।यह विधि जो वर्णित है वह अत्यधिक बहुमुखी है और इसका उपयोग प्रोटीन पुस्तकालयों के एक सरगम के मुद्रण के लिए किया जा सकता है, चाहे वे विशिष्ट प्रोटीन परिवार हों या हमारे जैसे प्रोटीन के बड़े संकलन हों। ब्याज के किसी भी प्रोटीन का मूल्यांकन किया जा सकता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय स्लाइड्स को देखभाल के साथ संभालना और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि वे बाहर सूख न जाएं ताकि मुद्रित प्रोटीन की गतिविधि के नुकसान को रोका जा सके।ब्याज के प्रोटीन की स्क्रीन के बाद, सतह प्लाज्मन प्रतिध्वनि जैसी ऑर्थोगोनल प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके देखी गई किसी भी हिट को और मान्य करने की अत्यधिक सलाह दी जाती है। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने शोधकर्ताओं के लिए मनुष्यों में बाह्राश प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने का मार्ग प्रशस्त किया है ।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1 और TRIP8b बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु inhibitors की पहचान के लिए विधि

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

एक सरल, मजबूत, और उच्च प्रवाह एकल अणु डीएनए के साथ अणुओं के परिवहन के अध्ययन के लिए परख कार्यांवयन खींच प्रवाह

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

प्रतिलेखन फैक्टर के उच्च संवेदनशीलता माप-प्रतिस्पर्धी अनुमापन द्वारा डीएनए बाध्यकारी समानताएं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को मापने के लिए माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस का उपयोग

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

प्रोटीन कम झूठ बोलने वाले अनुरूप राज्यों का पता लगाने के लिए उच्च दबाव एनएमआर प्रयोग

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

पुनः संयोजक जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक "दोहरी-अतिरिक्त" कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

उच्च-थ्रूपुट अलगाव और छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के शुद्धिकरण के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग मापदंडों का अनुकूलन

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

माइक्रोडायलिसिस के माध्यम से उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन क्रिस्टलीकरण

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...