Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Ringraziamo Philamer Calses e Kobe Yuen per leggere criticamente il manoscritto. Siamo grati a Randy Yen per la consulenza tecnica eccellente.

1. generazione di una libreria di proteine umane extracellulare
<ol><li>Compilare un elenco di recettori di superficie o proteine secrete di interesse per generare la libreria di microarray della proteina. Le famiglie di proteine specifiche (ad esempio, superfamiglia delle immunoglobuline) o proteine selettivamente espresso in particolare cella tipi possono essere selezionati per lo studio.</li>
	<li>Per recettori di superficie, è necessario determinare i limiti del dominio extracellulare (ECD) identificando il peptid...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

Un numero significativo di recettori orfani rimanga nel genoma umano, e nuovi interattori continuano ad emergere per proteine extracellulari con ligandi precedentemente caratterizzati. Definizione delle interazioni recettore-ligando in umani e organismi modello è essenziale per comprendere i meccanismi che determinano la comunicazione cellulare durante l'omeostasi, come pure la disregolazione che conducono alla malattia e quindi informare nuovi o migliorati opzioni terapeutiche. Tuttavia, rilevamento delle interazioni p...

Il metodo Recensito qui descrive la stampa di un insieme di proteine extracellulari in un formato di microarray, seguita da un metodo per lo screening di un target di interesse nei confronti di questa libreria. Abbiamo identificato multimerization proteina come un passo fondamentale per il rilevamento delle interazioni caratterizzate da affinità di legame basso. Per migliorare la rilevazione di queste interazioni, descriviamo un protocollo basato su multimerization della proteina di interesse utilizzando microsfere query.
Secreto e superficie-espresse proteine della cellula (collettivamente denominate proteine extracellulari) insieme ai loro partner interagenti sono regolatori chiave della comunicazione cellulare, di segnalazione e di interazione con il microambiente. Essi sono, pertanto, essenziale nella regolazione di molti processi fisiologici e patologici. Circa un quarto del genoma umano (≈5, 000 proteine) codifica per proteine extracellulari, che, dato il loro significato e accessibilità ai farmaci sistematicamente consegnati, rappresentano obiettivi chiave per droga sviluppo1. Di conseguenza, proteine extracellulari rappresentano oltre il 70% degli obiettivi della proteina con azione farmacologica nota per farmaci approvati sul mercato, conosciuto come il "proteoma trattabili". Nonostante la loro importanza e l'abbondanza, le reti di interazione (ePPI) extracellulare della proteina-proteina rimangono notevolmente sottorappresentate nei database disponibili. Questo è fondamentalmente a causa della natura complessa biochimica delle proteine extracellulari, che preclude loro caratterizzazione utilizzando tecnologie più disponibile2. In primo luogo, le proteine di membrana sono difficili da solubilizzare, un processo che coinvolge spesso condizioni di lavaggio difficili e detergenti; in secondo luogo, le proteine extracellulari spesso mancano rilevanti modificazioni post-traduzionali come glicosilazione che sono assenti quando queste proteine sono espresse in comunemente utilizzati sistemi eterologhi. Infine, interazioni tra recettori, quali co-recettori espressi sulle cellule immuni, sono spesso transitori e caratterizzate da bassissima affinità (KD nel μM ~ 1 a > 100 gamma μM). Complessivamente, la natura di queste proteine e la loro associazione partner di rendering più ampiamente utilizzate tecnologie quali la spettrometria di massa/purificazione di affinità (AP/MS) o lievito-due-ibrido, inadatto per il rilevamento delle interazioni nello spazio extracellulare 2 , 3.
Nel tentativo di superare queste sfide tecniche e accelerare la scoperta di nuove interazioni per proteine extracellulari, abbiamo sviluppato una copertura alta proteina extracellulare microarray4,5. I microarrays offrono il vantaggio di generare superfici ad alta densità con piccole quantità di campione e sono generalmente favorevoli agli studi elevato throughput. Studi basati su microarray di proteine precedentemente hanno fornito le comprensioni pertinenti in interazioni proteina per diversi organismi di modello, pur concentrandosi principalmente su interazioni citosolici o proteina specifica famiglie6,7, 8. Al contrario, limitati del lavoro è stato fatto per indagare le interazioni proteina extracellulare utilizzando questa tecnologia. Abbiamo sviluppato un metodo di microarray della proteina per attivare studi di ePPIs con la costruzione di una biblioteca completa e altamente diversificata di proteine secrete purificate e singola transmembrana (STM) recettori espressi come ricombinante domini extracellulari (ECD) fusi a comune tag per purificazione di affinità4. Il successo delle schermate di microarray di proteine si basa molto sull'istituzione di una biblioteca di proteine di alta qualità. Per l'espressione della proteina la biblioteca e la query, cellule di mammiferi o cellule di insetto preferenzialmente furono scelti come sistemi di espressione eterologa, per garantire la corretta aggiunta di modifiche post-traduzionali quali obbligazioni glicosilazione o bisolfuro. SDS-PAGE, cromatografia di esclusione di formato e diffusione della luce laser multi-angolo sono tecniche comunemente utilizzate per valutare la qualità delle proteine ricombinanti. La libreria di proteina è quindi individuata sui vetrini epoxysilane e conservata a-20 ° C per uso a lungo termine. Le concentrazioni di proteina di sopra di 0,4 mg/mL sono raccomandate per il protocollo descritto di seguito. Pertanto, basso-esprimere proteine possono richiedere un passaggio di concentrazione prima della stampa del campione e deposito. Tuttavia, un vantaggio principale di questa tecnica è la bassa quantità di proteina necessaria (50 μg di proteina è sufficiente effettuare > 2.000 schermi), al fianco di consumo di proteine minimo query (20-25 μg / schermo duplicati). Utilizzando il protocollo e le apparecchiature descritte qui, e purché le librerie siano disponibili, possono essere generati risultati per proteine singole query entro un giorno lavorativo.
Una sfida importante nella rilevazione di interazioni della proteina nell'ambiente extracellulare nasce dalla loro natura tipicamente transitoria o debole, che preclude l'identificazione di metodologie più comunemente utilizzati. Aumentando notevolmente l'avidità di legame, migliora la sensibilità per la rilevazione di proteine deboli interazioni9,10,11. Basato su questo principio abbiamo sviluppato un metodo per multimerize le proteine di query (espresse come fusione Fc) utilizzando proteine perline rivestite su A4,5. Per evitare qualsiasi potenziale inattivazione della proteina query di contrassegno casuale, abbiamo invece etichettare un'immunoglobulina umana irrilevante G con Cy5 e aggiungerlo insieme con la proteina di query per le perle di proteina A, eliminando così eventuali artefatti a causa la coniugazione diretta di un colorante per la proteina di interesse. Dato le affinità micromolari di diverse coppie di co-recettore, i complessi multivalenti migliorare notevolmente il rapporto segnale-rumore, rispetto alle proteine di query Fc-fusione proiettati come proteine solubili4.
In sintesi, l'obiettivo del presente protocollo è di descrivere la preparazione dei vetrini di microarray contenente una libreria di proteina extracellulare pre-esistenti per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando. Esaminiamo i passaggi per slide stampa, seguita da un protocollo per lo screening di una proteina di interesse contro la libreria di proteina extracellulare. Inoltre, descriviamo un metodo per migliorare il rilevamento di ePPIs basato su microsfere per raggiungere una maggiore avidità della proteina in esame. La tecnologia di microarray della proteina extracellulare qui descritta rappresenta un approccio veloce, affidabile ed efficace per lo screening e la rilevazione ePPI romanzo con bassi rapporti di falsi positivi e utilizzando solo quantità di microgrammo della proteina query sotto indagine. Questa tecnologia ha alimentato gli studi multipli che hanno fornito le comprensioni pertinenti in funzioni cellulari precedentemente sconosciute e vie di segnalazione per una varietà di recettori12,13, inclusi virali immunoregulators14, e possono essere utilizzate per-orphanize qualsiasi extracellulare della proteina di interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

Fattori secreti, recettori di membrana-tethered e loro interattori sono regolatori principali di comunicazione cellulare e l'inizio della cascata di segnalazione durante l'omeostasi e la malattia e come tali rappresentano bersagli terapeutici privilegiate. Nonostante la loro rilevanza, queste reti di interazione rimangono notevolmente sottorappresentate nei database correnti; di conseguenza, più proteine extracellulari non hanno documentato associazione partner. Questa discrepanza è principalmente dovuto le sfide connesse con lo studio delle proteine extracellulari, compreso l'espressione di proteine funzionali e la debole, bassa affinità, interazioni della proteina spesso stabiliti tra recettori di superficie. Lo scopo di questo metodo è di descrivere la stampa di una libreria di proteine extracellulari in un formato di microarray per lo screening delle interazioni proteina-proteina. Per attivare il rilevamento delle interazioni deboli, è descritto un metodo basato sul multimerization della proteina query in fase di studio. Accoppiato a questo approccio basato su Microperlina multimerization per maggiore multivalenza, il microarray di proteine permette di rilevamento affidabile delle interazioni proteina-proteina transitoria in elevato throughput. Questo metodo offre un campione rapidi e a basso consumo-approccio per l'identificazione di nuove interazioni applicabile a qualsiasi proteina extracellulare. Stampa di microarray della proteina ed il protocollo di screening sono descritti. Questa tecnologia sarà utile per gli investigatori che cercano un metodo affidabile per la scoperta delle interazioni della proteina nello spazio extracellulare.

Uno schema del flusso di lavoro per la tecnologia di microarray della proteina extracellulare è illustrato nella Figura 1. Una volta che le diapositive di microarray contenente la libreria di proteina extracellulare sono disponibili, lo screening della proteina di interesse e analisi dei dati può essere completato entro un giorno. Fisiologicamente rilevanti molte interazioni tra recettori di membrana incorporato sono caratterizzati da punti di forza molto d...

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Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Qui, presentiamo un protocollo di microarrays della proteina extracellulare dello schermo per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando romanzo in elevato throughput. Inoltre descriviamo un metodo per migliorare la rilevazione delle interazioni proteina-proteina transitoria utilizzando complessi proteina-Microperlina.

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni proteiche proteiche consentendo il rilevamento di nuovi partner leganti per proteine extracellulari, sia ad alta produttività che ad alta sensibilità. Il vantaggio principale di questo metodo è che, con pochi microgrammi di proteine, è possibile generare centinaia di diapositive utilizzando la stampante micro array. Utilizzare un micro arrayer standard per la stampa di diapositive.Questo strumento ha una capacità di 57 diapositive per corsa, utilizza una testina di stampa con 48 perni di avvistamento e può ospitare fino a 8.000 punti per diapositiva. Generare piastre di lavoro utilizzando 384 piastre di pozzo a 10 microlitri di campione per pozzo dalle piastre di serie. Eseguire questo passaggio manualmente, prima della stampa a scorrimento utilizzando il micro arrayer.Quindi individuare le proteine con perni di avvistamento di tipo quill su scivoli di silani epossidici al 60% di umidità per prevenire la disidratazione delle macchie proteiche. L'albumina del siero bovino etichettata Cy3 può essere individuata in duplice copia tra ogni campione proteico per visualizzare l'array per il montaggio della maschera. Dopo la stampa, rimuovere le diapositive di micro array proteico dall'ambiente umidificato.Quindi, utilizzare un fogger ad ultrasuoni per generare una nebbia fine di soluzione di blocco che si deposita sulla superficie di scorrimento. Quindi, bloccare le diapositive durante la notte con il 5% di latte in PBST per emanare la superficie. Conservare le diapositive a meno 20 gradi Celsius nel 50%glicerolo per evitare il congelamento.Le interazioni tra proteine extracellulari sono spesso caratterizzate dalle loro basse affinità. Per consentire il rilevamento di queste interazioni, aumentando l'avidità di legame, abbiamo sviluppato un approccio multivalente basato sulla cattura della proteina interrogata espressa come domini extracellulari taggati FC sulle micro perline rivestite di proteina A. Ruota l'IgG portante, che è stato etichettato con il colorante mono reattivo Cy5 come descritto nel protocollo di testo.Per calcolare il rapporto molare della proteina query e del Cy5 IgG, dividere il peso molecolare della proteina di query per il peso molecolare dell'IgG e moltiplicare per 40 microgrammi per millilitro per determinare la concentrazione di Cy5 IgG necessaria. Una volta determinati tutti i rapporti, formare il complesso proteico delle micro perline combinando la query taggata FC e il Cy5 IgG con la proteina A micro perline. Mescolare le sospensioni in PBS su un rotatore a tubo per 30 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce.Per iniziare lo screening, riscaldare gli scivoli preparati a temperatura ambiente prima di caricarsi sulla stazione di ibridazione. Per eseguire lo screening, lavare prima il micro array con PBST per un minuto per rimuovere il glicerolo residuo. Caricare 200 microlitri di un milligrammo per millilitro proteina A nel latte PBS al 5% e incubare per 30 minuti per evitare che le micro perline proteiche non complesse A si attacchino alle proteine etichettate FC che possono essere presenti nel micro array.Dopo che la stazione di ibridazione lava le diapositive con PBST, caricare 200 microlitri del complesso di micro perline query, in presenza di un milligrammo per proteina millilitro A e incubare per 30 minuti. Dopo l'ibridazione e il lavaggio delle diapositive da parte della stazione di ibridazione, sciacquare gli scivoli con acqua e metterli in singoli tubi conici da 50 millilitri. Asciugare i tubi girando a 900 volte G per cinque minuti.Infine, scansiona le diapositive con uno scanner micro array appropriato per rilevare la fluorescenza Cy3 e Cy5, rispettivamente a 532 e 635 nanometri. Ecco un'immagine rappresentativa di una diapositiva stampata. Le macchie di albumina del siero bovino etichettate Cy3 sono in verde.I punti sono stati stampati in duplice copia come controllo di qualità del processo di stampa. I risultati rappresentativi di una proteina orfana, vengono visualizzati qui per l'identificazione di partner leganti utilizzando la tecnologia micro array proteica extracellulare. Le macchie rosse duplicate sono identificate come un successo per la proteina di query schermata.Questo metodo descritto è altamente versatile e può essere utilizzato per la stampa di una gamma di librerie proteiche, siano esse specifiche famiglie proteiche o grandi raccolte di proteine come la nostra. Qualsiasi proteina di interesse può essere valutata. Durante il tentativo di questa procedura è importante gestire le diapositive con cura e assicurarsi che non si asciughino in modo da prevenire la perdita di attività delle proteine stampate.Seguendo lo schermo di una proteina di interesse, si consiglia vivamente di convalidare ulteriormente eventuali colpi osservati utilizzando tecnologie ortogonali, come la risonanza plasmonica di superficie. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per studiare le interazioni proteiche extracellulari nell'uomo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Ricerca

Biochimica

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Una singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione del flusso Stretching Assay implementazione per studiare il trasporto di molecole lungo DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

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High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Alta sensibilità misura dell'affinità di legame di DNA di fattore di trascrizione per titolazione competitivo mediante microscopia a fluorescenza

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Esperimenti NMR ad alta pressione per il rilevamento di stati conformazionali a bassa pressione delle proteine

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Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

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Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

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Cristallizzazione delle proteine ad alto rendimento tramite microdialisi

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