Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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우리 감사 Philamer Calses와 고베 yuen의 비판적 원고를 읽고. 우리는 우수한 기술 조언을 랜디 엔 감사입니다.

1. 휴먼 Extracellular 단백질의 라이브러리의 생성
<ol><li>세포 표면 수용 체 또는 단백질 microarray 라이브러리를 구축 하는 관심사의 단백질 분 비의 목록을 컴파일하십시오. 특정 단백질 가족 (예를 들어 면역 글로불린 superfamily) 또는 단백질 선택적으로 표현 특히 세포 연구에 대 한 유형을 선택할 수 있습니다.</li>
	<li>세포 표면 수용 체에 대 한 신호 펩 티 드 및 소프트웨어 도구를 사용 하 여 막 횡?...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

고아 수용 체의 상당수는 인간 게놈에 남아 고 소설 상호 작용 파트너 이전 특징이 ligands과 세포 외 단백질에 대 한 등장을 계속 합니다. 항상성, 뿐만 아니라 질병, 이어지는 dysregulation 셀룰러 통신을 지정 하는 메커니즘을 이해 하 고 따라서 새로운 또는 향상 된 알려 필수적 이다 모형 유기 체 및 인간 상호 작용 수용 체 ligand 정의 치료 옵션입니다. 그럼에도 불구 하 고, 널리 사용 되는 기술에 의...

여기에 검토 하는 방법은 세포 외 단백질 microarray 형식,이 라이브러리에 대 한 관심의 대상의 심사에 대 한 방법으로 다음의 컬렉션의 인쇄를 설명 합니다. 우리는 낮은 바인딩 선호도 특징 상호 작용 검출을 위한 중요 한 단계로 단백질 multimerization를 확인 했습니다. 이러한 상호 작용의 탐지를 향상 시키기 위해, 우리 microbeads를 사용 하 여 관심사의 쿼리 단백질의 multimerization에 따라 프로토콜을 설명 합니다.
분 비 되며 세포 표면 표현 단백질 (총칭 하 여 세포 외 단백질에 게 불리는) 그들의 상호 작용 협동자 함께 셀룰러 통신, 신호 및는 microenvironment와의 상호 작용의 주요 레 귤 레이 터. 그들은, 따라서, 많은 생리와 병리학 과정 조절에 필수적인입니다. 인간 게놈 (≈5, 000 단백질)의 4 분의 1 약 extracellular 단백질에 대 한 인코딩, 체계적으로 전달 된 약물에 게 그들의 의미 및 접근성, 대표 약물 개발1에 대 한 주요 대상. 따라서, 세포 외 단백질 단백질 목표 시장, "druggable proteome"로 알려진에 승인 된 약물에 대 한 알려진 약리 작업의 70% 이상 대표. 그들의 중요성 및 풍부에도 불구 하 고 세포 외 단백질-단백질 상호 작용 (ePPI) 네트워크 현저 하 게 underrepresented 사용 가능한 데이터베이스에 남아 있습니다. 이것은 근본적으로 대부분의 사용 가능한 기술2를 사용 하 여 그들의 특성화 하는 걸로 extracellular 단백질의 복잡 한 생 화 확 적인 성격 때문 이다. 첫째, 막 단백질은 어려운 solubilize, 종종 거친 세척 조건 및 세제;를 포함 하는 프로세스 둘째, 세포 외 단백질 종종 부족 관련 포스트 번역 상 수정 때이 단백질은 표현에 일반적으로 결 석 있다 glycosylation 분리 시스템을 사용 합니다. 마지막으로, 같은 공동 수용 체 면역 세포에 수용 체 사이 상호 작용은 종종 과도 하 고 특징이 매우 낮은 선호도 (하 ~ 1 μ M에서 KD > 100 μ M 범위). 모두,이 단백질과 그들의 바인딩 파트너 가장 널리 렌더링의 자연 친 화력 정화/질량 분석 (AP/MS) 또는 효 모-2-하이브리드, 세포 외 공간에서 상호 작용의 탐지에 대 한 부적 절 한 같은 기술을 활용 2 , 3.
이러한 기술적 과제를 극복 하 고 extracellular 단백질에 대 한 새로운 상호 작용의 발견을 촉진 하기 위해, 우리는 높은 범위 extracellular 단백질 microarray4,5를 개발 했습니다. Microarrays 소량 샘플, 고밀도 표면 생성의 이점을 제공 하 고 높은 처리량 연구를 일반적으로 받을. 주로 특정 단백질 가족6,7, 또는 cytosolic 상호 작용에 초점을 맞추고 이기는 하지만 단백질 microarray 기반 연구 이전 여러 모델에 대 한 유기 체를 위한 단백질 상호 작용에 관련 된 통찰력 제공 8. 반면, 제한 된 작업은이 기술을 사용 하 여 세포 외 단백질 상호 작용을 조사 하기 위해 수행 되었습니다. 우리 정화 분 비 단백질의 포괄적이 고 매우 다양 한 라이브러리를 구축 하 여 ePPIs의 연구를 활성화 하는 단백질 microarray 방법을 개발 하 고 하나의 막 횡단 (STM) 수용 체 표현으로 재조합 세포 외 도메인 (ECD)에 융합 친 화력 정화4공통 태그 단백질 microarray 스크린의 성공 고품질 단백질 라이브러리의 설립에 크게 의존합니다. 라이브러리 및 쿼리 단백질의 표현을 위한 포유류 세포 또는 곤충 세포 우선적으로 선택 되었다 분리 식 시스템, 포스트 번역 상 수정 glycosylation 또는 이황화 채권 등의 적절 한 추가 되도록. SDS 페이지, 크기 배제 크로마토그래피 및 멀티 앵글 레이저 광 산란 일반적으로 재조합 단백질 품질을 평가 하기 위해 활용 하는 기술이 있습니다. 단백질 라이브러리는 다음 epoxysilane 슬라이드에 발견 하 고 장기간 사용-20 ° C에 저장. 0.4 mg/mL의 위 단백질 농도 프로토콜 아래에 설명 된 권장 됩니다. 따라서, 낮은 표현 단백질 농도 단계 샘플 인쇄 및 저장 하기 전에 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 기술의 주요 장점은 작은 양의 필요한 단백질 (단백질의 50 μ g은 수행 하기에 충분 한 > 2000 화면), 최소 쿼리 단백질 소비 (중복 화면 당 20-25 μ g)와 함께. 프로토콜 및 장비를 사용 하 여 설명, 그리고 제공 하는 라이브러리를 사용할 수 있는 개별 쿼리 단백질에 대 한 결과 1 작업 일 안에 생성 될 수 있습니다.
Extracellular 환경에 있는 단백질 상호 작용을 감지 하는 주요 과제는 가장 일반적으로 사용 되는 방법론에 의해 식별을 방해 그들의 특질 상 약하거나 과도 자연에서 발생 합니다. 바인딩 갈망을 크게 증가 약한 단백질 상호 작용9,,1011의 검출 감도 향상 시킵니다. 우리 multimerize 하는 방법을 개발 하는이 원칙에 따라 (Fc 융합으로 표현) 쿼리 단백질 단백질 A 코팅 구슬4,5를 사용 하 여. 무작위 라벨 쿼리 단백질의 어떤 잠재적인 비활성화를 방지, 우리 대신는 무관 한 인간 면역 글로불린 G와 Cy5 라벨을 추가 쿼리 단백질 함께 단백질 A 구슬에 따라서의 직접 활용으로 인해 모든 아티팩트를 제거는 관심사의 단백질에 염료. 여러 공동 수용 체 쌍의 micromolar 선호도 감안할 때, multivalent 단지 크게 신호 대 잡음 비, Fc-퓨전 쿼리 단백질 용 해 단백질4상영에 비해 향상 시킬.
요약 하자면,이 프로토콜의 목표 microarray 슬라이드 포함 하는 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 위해 기존의 세포 외 단백질 라이브러리의 준비를 설명 하는입니다. 우리는 슬라이드 인쇄, extracellular 단백질 라이브러리에 대 한 관심사의 단백질의 심사에 대 한 프로토콜에 대 한 단계를 검토 합니다. 또한, 우리는 연구에서 단백질의 증가 된 갈망을 달성 하기 위해 microbeads에 따라 ePPIs의 향상 된 검색 하는 방법을 설명 합니다. 여기에 설명 된 세포 외 단백질 microarray 기술 심사 및 낮은 허위 양성 비율와 소설 ePPI 감지만 그램 양의 아래 쿼리 단백질을 이용 하 여 빠르고, 강력 하 고 효과적인 접근 방식을 나타냅니다. 조사입니다. 이 기술 수용 체12,13,14, 바이러스 성 immunoregulators 포함 하 여 다양 한을 위한 이전에 알려지지 않은 세포 기능 및 신호 경로에 관련 된 통찰력을 제공 하는 여러 연구를 자극 했다 그리고 드 orphanize 관심사의 어떤 세포 외 단백질을 이용 될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

분 비 요인, 곁에 막 수용 체 그리고 그들의 상호 작용 협동자 셀룰러 통신의 주요 레 귤 레이 터 및 항상성 및 질병, 폭포를 신호의 시작 이며 같은 대표 주요 치료 대상. 이러한 상호 작용 네트워크 그들의 관련성에도 불구 하 고 현재 데이터베이스;에서 크게 이루어지지 남아 따라서, 세포 외 단백질 가장 문서화 바인딩 파트너가 있다. 이 불일치는 주로 기능 단백질, 고 약한, 낮은 선호도, 단백질 상호 작용 세포 표면 수용 체 간에 자주 설정의 식을 포함 하 여 세포 외 단백질의 연구와 관련 된 문제 때문입니다. 이 방법의 목적은 세포 외 단백질 단백질 단백질 상호 작용의 심사에 대 한 microarray 형식 라이브러리의 설명 이다. 약한 상호 작용의 탐지를 사용 하려면 쿼리 단백질 연구의 multimerization에 따라 메서드를 설명 합니다. 증가 multivalency이 multimerization microbead 기반 접근을 결합, 단백질 microarray 높은 처리량 과도 단백질-단백질 상호 작용의 강력한 검색을 수 있습니다. 이 메서드는 신속 하 고 낮은 샘플 사용-접근 어떤 세포 외 단백질에 적용 가능한 새로운 상호 작용의 식별을 위해 제공합니다. 단백질 microarray 인쇄 및 심사 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 세포 외 공간 상호 작용 단백질의 발견에 대 한 강력한 방법을 추구 하는 수 사관을 위해 유용할 것 이다.

세포 외 단백질 microarray 기술에 대 한 워크플로의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 세포 외 단백질 라이브러리를 포함 하는 microarray 슬라이드 사용할 수 있습니다, 일단 관심 및 데이터 분석의 단백질의 심사는 1 일 안에 완료할 수 있습니다. 멤브레인 포함 수용 체 간의 많은 순수 관련 상호 작용 매우 약한 바인딩 강점 (KD micromolar 범위에서) 특?...

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Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

이 방법은 높은 처리량과 높은 감도 모두 세포 외 단백질에 대한 새로운 결합 파트너의 검출을 가능하게함으로써 단백질 단백질 상호 작용 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 몇 마이크로그램의 단백질만 으로 마이크로 어레이 프린터를 사용하여 수백 개의 슬라이드를 생성할 수 있다는 것입니다. 슬라이드 인쇄에 표준 마이크로 어레이어를 사용합니다.이 계측기는 런당 57개의 슬라이드를 사용할 수 있으며, 48개의 스포팅 핀을 들고 있는 프린트 헤드를 사용하며 슬라이드당 최대 8, 000개의 스팟을 수용할 수 있습니다. 스톡 플레이트에서 잘 샘플 10 마이크로 리터에서 384 개의 웰 플레이트를 사용하여 작업 플레이트를 생성합니다. 마이크로 어레이를 사용하여 슬라이드 인쇄하기 전에 이 단계를 수동으로 수행합니다.그런 다음 에폭시 실레인 슬라이드에 퀼 타입 스포팅 핀이 있는 단백질을 60%의 습도로 찾아 단백질 반점의 탈수를 방지합니다. Cy3 표지된 소 혈청 알부민은 마스크 피팅을 위한 어레이를 시각화하기 위해 각 단백질 샘플 사이에 중복된 것으로 발견될 수 있다. 인쇄 후, 가습 된 환경에서 단백질 마이크로 어레이 슬라이드를 제거합니다.다음으로 초음파 포저를 사용하여 슬라이드 표면에 정착하는 차단 용액의 미세한 안개를 생성합니다. 그런 다음 PBST에서 5 %의 우유로 밤새 슬라이드를 차단하여 표면을 활성화시합니다. 동결을 방지하기 위해 50 % 글리세롤에서 영하 20도에서 슬라이드를 저장합니다.세포 외 단백질 간의 상호 작용은 종종 낮은 친화력을 특징으로합니다. 이러한 상호작용의 검출을 가능하게 하기 위해, 결합 적 확대를 증가시킴으로써, 우리는 FC태그가 지정된 쿼리된 단백질의 캡처에 기초하여 다원적 접근법을 개발했다 단백질 A 코팅 마이크로 비드에 세포외 도메인을 태그. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Cy5 모노 반응성 염료로 레이블이 지정된 반송파 IgG를 회전합니다.쿼리 단백질 및 Cy5 IgG의 어금니 비율을 계산하기 위해, 질의 단백질의 분자량을 IgG의 분자량으로 나누고 밀리리터당 40 마이크로그램을 곱하여 Cy5 IgG의 농도를 결정한다. 일단 모든 비율이 결정되면 FC 태그 쿼리및 Cy5 IgG를 단백질 A 마이크로 비드와 결합하여 마이크로 비드 단백질 복합체를 형성하였다. 실내 온도에서 30분 동안 튜브 회전기에서 PBS의 서스펜션을 혼합하여 빛으로부터 보호합니다.스크리닝을 시작하려면, 하이브리드화 스테이션에 로드하기 전에 실온에서 준비된 슬라이드를 따뜻하게 한다. 스크리닝을 수행하려면 먼저 PBST로 마이크로 어레이를 1분 동안 세척하여 잔류 글리세롤을 제거합니다. PBS 5%우유에 밀리리터 단백질 A당 1밀리그램의 200 마이크로리터를 적재하고 30분 동안 배양하여 복잡하지 않은 단백질 A 마이크로 비즈가 마이크로 어레이에 존재할 수 있는 FC 태그 단백질에 결합하지 못하도록 합니다.혼성화 스테이션이 PBST로 슬라이드를 감산한 후, 밀리리터 단백질 A당 1밀리그램이 존재하여 쿼리 마이크로 비드 복합체200 마이크로리터를 적재하고 30분 동안 배양한다. 혼성화 스테이션에 의해 슬라이드의 혼성화 및 세척에 따라, 물로 슬라이드를 헹구고 개별 50 밀리리터 원모형 튜브에 배치합니다. 5 분 동안 900 배 G에서 회전하여 튜브를 건조.마지막으로, 각각 532 및 635 나노미터에서 흥미 진진한 으로 Cy3 및 Cy5 형광을 검출하는 데 적합한 마이크로 어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔하십시오. 여기에 인쇄된 슬라이드의 대표적인 이미지가 표시됩니다. Cy3 라벨소 소 세럼 알부민 스팟은 녹색입니다.반점은 인쇄 공정의 품질 관리로 복제하여 인쇄되었습니다. 세포외 단백질 마이크로 어레이 기술을 사용하여 결합 파트너의 식별을 위해 선별된 고아 단백질의 대표적인 결과는 여기에 나와 있다. 중복 된 적색 반점은 선별 된 쿼리 단백질에 대한 히트로 식별됩니다.설명되는 이 방법은 매우 다재다능하며 단백질 라이브러리의 영역 인쇄에 사용될 수 있으며, 특정 단백질 패밀리 또는 우리와 같은 단백질의 큰 편집이 될 수 있습니다. 관심있는 단백질은 평가 될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 주의슬라이드를 처리하고 인쇄된 단백질의 활동 손실을 방지하기 위해 건조하지 않도록 하는 것이 중요합니다.관심 있는 단백질의 스크린에 이어, 표면 플라스몬 공명과 같은 직교 기술을 사용하여 관찰된 모든 안타를 더 검증하는 것이 좋습니다. 개발 후, 이 기술은 연구원이 인간에 있는 세포외 단백질 상호 작용을 공부하는 쪽을 포장했습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

간단 하 고 강력한, 높은 처리량 단일 분자 DNA에 따라 분자의 수송을 공부에 대 한 스트레칭 분석 결과 구현 흐름

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

단백질 저거짓말 형성 상태를 검출하기 위한 고압 NMR 실험

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...