Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Vi takker Philamer Calses og Kobe Yuen for kritisk lesing manuskriptet. Vi er takknemlige til Randy Yen for gode tekniske råd.

1. generasjon av et bibliotek av ekstracellulære menneskelige proteiner
<ol><li>Kompilere en liste over celleoverflaten reseptorer eller utskilles proteiner av interesse å bygge protein microarray biblioteket. Bestemt protein familier (for eksempel immunglobulin gruppe) eller proteiner uttrykte selektivt spesielt cellen typer kan bli valgt for studien.</li>
	<li>For celleoverflaten reseptorer, fastslå ekstracellulære domenet (ECD) grensene av identifiserer signal peptid og transmembrane regioner med programvareverk...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

Et betydelig antall foreldreløs reseptorer beholdes i det menneskelige genomet, og romanen samspill partnere fortsette å dukke opp for ekstracellulære proteiner med tidligere preget ligander. Reseptor-ligand interaksjoner i human og modell organismer er viktig å forstå mekanismene som styrer mobil kommunikasjon homeostase, samt feilregulering fører til sykdom og derfor informere nye eller forbedrede behandlingsalternativer. Likevel har påvisning av ekstracellulære protein interaksjoner av brukte technologies repr...

Metoden omtalt her beskriver utskrift av en samling av ekstracellulære proteiner i et microarray format, etterfulgt av en metode for screening av et mål av interesse mot dette biblioteket. Vi har identifisert protein multimerization som et viktig skritt for påvisning av interaksjoner preget av lav bindende slektskap. For å forbedre gjenkjenning av disse interaksjoner, beskriver vi en protokoll basert på multimerization av spørringen protein rundt ved hjelp av microbeads.
Skilles ut celle overflaten-uttrykt proteiner (kollektivt kalt ekstracellulære proteiner) sammen med samarbeidspartnerne samhandlende er viktige regulatorer av mobil kommunikasjon, signalisering og samspill med microenvironment. De er derfor viktige i å regulere mange fysiologiske og patologiske prosesser. Omtrent en fjerdedel av det menneskelige genomet (≈5, 000 proteiner) koder for ekstracellulære proteiner, som, gitt deres betydning og tilgjengelighet til systematisk leverte narkotika, representerer viktige mål for narkotika utvikling1. Følgelig representerer ekstracellulære proteiner mer enn 70% av protein mål med kjente farmakologisk handling for godkjente legemidler på markedet, kjent som "druggable proteom". Til tross for deres betydning og overflod forblir den ekstracellulære protein-protein interaksjon (ePPI) nettverk bemerkelsesverdig underrepresentert i tilgjengelige databaser. Dette er fundamentalt komplekse biokjemiske innholdet i de ekstracellulære proteinene, som utelukker sin karakteristikk bruker mest tilgjengelige teknologier2. Først er membran proteiner vanskelig å solubilize, en prosess som involverer ofte harde vask forhold og vaskemidler; Dernest mangler ekstracellulære proteiner ofte relevante post-translasjonell modifikasjoner som glykosylering som er fraværende når disse proteinene er uttrykt i vanligvis brukt heterologous systemer. Til slutt, samspillet mellom reseptorer, som co reseptorer uttrykt på immunceller, er ofte midlertidig og preget av svært lav slektskap (KD i ~ 1 μM til > 100 μM utvalg). Sammen benyttet disse proteinene og deres bindende partnere gjengi mest teknologi, for eksempel rensing/massespektrometri med affinitet (AP/MS) eller gjær-to-hybrid, uegnet for påvisning av interaksjoner i ekstracellulære plass 2 , 3.
I et forsøk på å overvinne disse tekniske utfordringer og akselerere oppdagelsen av romanen samhandlinger for ekstracellulære proteiner, har vi utviklet en høy dekning ekstracellulære protein microarray4,5. Microarrays tilbyr fordelen av generere høy tetthet overflater med små mengder av prøven, og er generelt mottakelig for høy gjennomstrømning studier. Protein microarray-baserte studier har tidligere gitt relevant innsikt i protein interaksjoner for flere modell organismer, men hovedsakelig fokuserer på cytosolic interaksjoner eller bestemt protein familier6,7, 8. Sammenligning har begrenset arbeid blitt gjort for å undersøke ekstracellulære protein interaksjoner ved hjelp av denne teknologien. Vi har utviklet en protein microarray metode for å aktivere studier av ePPIs ved å bygge en omfattende og svært variert bibliotek av renset utskilles proteiner og enkelt transmembrane (STM) reseptorer uttrykt som rekombinant ekstracellulære domener (ECD) del felles koder for affinitet rensing4. Suksessen av protein microarray skjermene stoler tungt på etablering av et høykvalitets protein bibliotek. For uttrykk for både bibliotek og spørring protein, pattedyrceller eller insekt celler var preferentially valgt heterologous uttrykk systemer, å sikre riktig tillegg post-translasjonell modifikasjoner som glykosylering eller disulphide obligasjoner. SDS side, størrelse utelukkelse kromatografi og multivinkel laserlys spredning er teknikker vanligvis benyttes for å vurdere rekombinant protein kvalitet. Protein biblioteket deretter oppdaget på epoxysilane lysbilder og lagret på 20 ° C for langsiktig bruk. Protein konsentrasjoner over 0,4 mg/ml er anbefalt for protokollen beskrevet nedenfor. Derfor krever lav-uttrykke proteiner litt konsentrasjon før eksempel utskrift og lagring. Likevel en viktig nytte av denne teknikken er små volumet av protein kreves (50 μg protein er tilstrekkelig til å utføre > 2000 skjermer), sammen med minimal spørringen protein konsum (20-25 μg per duplikater skjermen). Ved hjelp av protokollen og utstyr beskrevet her, og bibliotekene er tilgjengelig, resultater for individuelle spørringen proteiner kan genereres innen én virkedag.
En stor utfordring i å oppdage protein interaksjoner i ekstracellulære miljøet oppstår fra deres karakteristisk svak eller forbigående Art, som utelukker identifikasjon av mest brukte metoder. Økende bindende avidity sterkt forbedrer følsomhet for gjenkjenning av svak protein interaksjoner9,10,11. Basert på dette prinsippet vi utviklet en metode for å multimerize spørring proteiner (uttrykt som Fc fusion) bruke protein A-belagt perler4,5. For å unngå noen potensielle inaktivering av spørringen protein ved tilfeldig merking, vi i stedet merke en irrelevante menneskelige immunglobulin G med Cy5 og legge den sammen med spørringen protein til protein A perler, dermed eliminere noen gjenstander på grunn av den direkte Bøyning av en fargestoff protein av interesse. Gitt de micromolar slektskap av flere co reseptor, forbedre multivalent komplekser kraftig signal til støyforhold, sammenlignet med Fc-fusion spørringen proteiner vist som løselig proteiner4.
Oppsummert er målet med denne protokollen til å beskrive utarbeidelse av microarray lysbilder som inneholder et eksisterende ekstracellulære protein bibliotek for identifikasjon av reseptor-ligand interaksjoner. Vi går gjennom trinnene for lysbildet utskrift, etterfulgt av en protokoll for screening av et protein av interesse mot ekstracellulære protein biblioteket. Videre beskriver vi en metode for bedre gjenkjenning av ePPIs basert på microbeads å oppnå økt avidity av proteinet under studien. Den ekstracellulære protein microarray teknologien beskrevet her representerer en rask, robust og effektiv tilnærming til screening og oppdage romanen ePPI med lav false-positiv forholdstall, og ved å bruke bare mikrogram mengder spørringen protein under gransking. Denne teknologien har drevet flere studier som har gitt relevant innsikt i tidligere ukjent cellulære funksjoner og signalnettverk trasé for en rekke reseptorer12,13, inkludert viral immunoregulators14, og kan brukes til å orphanize de alle ekstracellulære protein av interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

Utskilles faktorer, membran-bundet reseptorer og samarbeidspartnerne samhandlende viktigste regulatorer av mobil kommunikasjon og initiering signalnettverk cascades homeostase og sykdom, og representerer som førsteklasses terapeutiske mål. Til tross for deres relevans fortsatt disse samhandling nettverkene betydelig underrepresentert i gjeldende databaser; Derfor har mest ekstracellulære proteiner ingen dokumentert bindende partner. Dette avviket skyldes hovedsakelig utfordringene knyttet til studiet av de ekstracellulære proteinene, inkludert uttrykk for funksjonell proteiner og svakt, lav affinitet, protein interaksjoner ofte etablert mellom celleoverflaten reseptorer. Formålet med denne metoden er å beskrive utskrift av et bibliotek av ekstracellulære proteiner i et microarray format for screening av protein-protein interaksjoner. For å aktivere gjenkjenning av svake interaksjoner, er en metode basert på multimerization av spørringen protein under studien beskrevet. Koblet til denne microbead-baserte multimerization for økt multivalency, gir den protein microarray robust oppdaging av forbigående protein-protein interaksjoner i høy gjennomstrømning. Denne metoden tilbyr en rask og lav forbruker-tilnærming for identifisering av nye samhandlinger gjelder for alle ekstracellulære protein. Protein microarray utskrift og screening protokoll er beskrevet. Denne teknologien vil være nyttig for etterforskere søker en robust metode for oppdagelse av protein interaksjoner i ekstracellulære plass.

En skjematisk for arbeidsflyten for den ekstracellulære protein microarray teknologien er vist i figur 1. Når microarray lysbildene inneholder ekstracellulære protein biblioteket er tilgjengelig, kan screening av protein av interesse og dataanalyse fullføres innen en dag. Mange fysiologisk relevante interaksjoner mellom membran-embedded reseptorer er preget av svært svak bindende styrker (KD i micromolar området). For å forbedre gjenkjenning...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Her presenterer vi en protokoll til skjermen ekstracellulære protein microarrays for identifikasjon av romanen reseptor-ligand interaksjoner i høy gjennomstrømning. Vi har også beskriver en metode for å forbedre gjenkjenning av forbigående protein-protein interaksjoner ved hjelp av protein-microbead komplekser.

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen proteinproteininteraksjoner ved å muliggjøre påvisning av nye bindende partnere for ekstracellulære proteiner, både i høy gjennomstrømning og med høy følsomhet. Den største fordelen med denne metoden er at med bare noen få mikrogram protein, kan du generere hundrevis av lysbilder ved hjelp av mikromatriseskriveren. Bruk en standard mikromatriser for lysbildeutskrift.Dette instrumentet har en kapasitet på 57 lysbilder per kjøring, bruker et skrivehode som holder 48 spotting pinner, og har plass til opptil 8000 flekker per lysbilde. Generer arbeidsplater ved hjelp av 384 brønnplater ved 10 mikroliter prøve per brønn fra lagerplatene. Utfør dette trinnet manuelt før du skyver utskriften ved hjelp av mikromateren.Deretter spot proteiner med quill type spotting pinner på epoxy silane lysbilder på 60% fuktighet for å hindre dehydrering av protein flekker. Cy3 merket storfe serum albumin kan sees i duplikat mellom hver protein prøve for å visualisere array for maske montering. Etter utskrift fjerner du proteinmikromatrisen fra det fuktede miljøet.Deretter bruker du en ultralydtåker for å generere en fin tåke av blokkeringsløsning som legger seg på lysbildeoverflaten. Deretter blokkerer lysbildene over natten med 5% melk i PBST for å aktivere overflaten. Lagre lysbilder på minus 20 grader Celsius i 50% glyserol for å hindre frysing.Interaksjoner mellom ekstracellulære proteiner er ofte preget av deres lave affiniteter. For å muliggjøre påvisning av disse interaksjonene, utviklet vi ved å øke den bindende iiditeten en multivalent tilnærming basert på fangst av det spurte proteinet uttrykt som FC-merkede ekstracellulære domener på protein A-belagte mikroperler. Spinn transportøren IgG, som har blitt merket med Cy5 mono reaktiv fargestoff som beskrevet i tekstprotokollen.For å beregne molarforholdet til spørringsproteinet og Cy5 IgG, del den molekylære vekten av spørringsproteinet med den molekylære vekten av IgG og multipliserer med 40 mikrogram per milliliter for å bestemme konsentrasjonen av Cy5 IgG som trengs. Når alle forholdene er bestemt danner mikroperleproteinkomplekset ved å kombinere FC-kodet spørring og Cy5 IgG med proteinet A mikroperler. Bland suspensjonen i PBS på en rørrotator i 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys.For å starte screeningen, varm de forberedte lysbildene ved romtemperatur før du laster på hybridiseringsstasjonen. For å utføre screeningen, vask først mikromatrisen med PBST i ett minutt for å fjerne gjenværende glyserol. Last 200 mikroliter av ett mg per milliliter protein A i PBS 5% melk og inkuber i 30 minutter for å forhindre ukomplekset protein A mikroperler fra binding til FC-merkede proteiner som kan være tilstede i mikromatrisen.Etter hybridiseringstasjonen vasker lysbildene med PBST, laster du 200 mikroliter av spørringsmikroperlekomplekset, i nærvær av ett milligram per milliliter protein A og inkubere i 30 minutter. Etter hybridisering og vasking av lysbildene ved hybridiseringsstasjonen, skyll lysbilder med vann og legg dem i individuelle 50 milliliter koniske rør. Tørk rørene ved å spinne ved 900 ganger G i fem minutter.Til slutt skanner du lysbildene med en mikroarrayskanner som passer for å oppdage Cy3 og Cy5 fluorescens ved å spenne på henholdsvis 532 og 635 nanometer. Vist her er et representativt bilde av et utskrevet lysbilde. Den Cy3 merket storfe serum albumin flekker er i grønt.Flekkene ble skrevet ut i duplikat som en kvalitetskontroll av utskriftsprosessen. Representative resultater av et foreldreløst protein, screenet for identifisering av bindende partnere ved hjelp av den ekstracellulære proteinmikroarrayteknologien, vises her. De dupliserte røde flekkene identifiseres som et treff for det skjermede spørringsproteinet.Denne metoden som er beskrevet er svært allsidig og kan brukes til utskrift av et spekter av proteinbiblioteker, det være seg spesifikke proteinfamilier eller store samlinger av proteiner som vår. Ethvert protein av interesse kan evalueres. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å håndtere lysbildene med forsiktighet og for å sikre at de ikke tørker ut for å forhindre tap av aktivitet av proteinene som skrives ut.Etter skjermen av et protein av interesse, anbefales det sterkt å ytterligere validere eventuelle treff observert ved hjelp av ortogonale teknologier, for eksempel overflateplasmonresonans. Etter utviklingen har denne teknikken banet vei for forskere å studere ekstracellulære proteininteraksjoner hos mennesker.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyte strekker analysen implementering for å studere Transport av molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Høytrykks NMR-eksperimenter for å oppdage protein lavtliggende konformasjonstilstander

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

En "dual-addisjon" kalsiumfluorescensanalyse for høy gjennomstrømningsscreening av rekombinante G-proteinkoblede reseptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimalisering av flowcytometriske sorteringsparametere for høykapasitetsisolering og rensing av små ekstracellulære vesikler

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Proteinkrystallisering med høy gjennomstrømning via mikrodialyse

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...