Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Agradecemos Philamer Calses e Kobe Yuen criticamente a ler o manuscrito. Nós somos gratos a Randy Yen para aconselhamento técnico excelente.

1. geração de uma biblioteca de proteínas humanas extracelulares
<ol><li>Compile uma lista de receptores de superfície celular ou proteínas secretadas de interesse para criar a biblioteca de microarray de proteína. Famílias de proteínas específicas (por exemplo, a superfamília das imunoglobulinas) ou proteínas seletivamente expressaram em particular célula tipos que podem ser selecionados para o estudo.</li>
	<li>Para receptores de superfície celular, determine os limites do domínio extracelular (ECD), id...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

Um número significativo de órfãos receptores permanecem no genoma humano, e novos parceiros de interação continuam a emergir para proteínas extracelulares com ligantes anteriormente caracterizadas. Definindo as interações ligante-receptor em humanos e organismos modelo é essencial para compreender os mecanismos que determinam a comunicação celular durante a homeostase, bem como a desregulação levando a doença e, portanto, informar novos ou melhorados opções terapêuticas. Não obstante, deteção de inter...

O método aqui analisado descreve a impressão de uma coleção de proteínas extracelulares em um formato de microarray, seguido por um método para a seleção de um alvo de interesse com esta biblioteca. Nós identificamos proteínas multimerization como um passo crucial para a deteção de interações caracterizada por afinidades de ligação baixa. Para realçar a deteção dessas interações, descrevemos um protocolo baseado em multimerization da proteína de interesse usando microbeads consulta.
Segregada e célula superfície-expresso proteínas (coletivamente denominadas proteínas extracelulares) juntamente com seus parceiros de interação são reguladores chaves da comunicação celular, sinalização e interação com o microambiente. Eles são, portanto, essenciais na regulação de muitos processos fisiológicos e patológicos. Aproximadamente um quarto do genoma humano (≈5, 000 proteínas) codifica para proteínas extracelulares, que, dado o seu significado e acessibilidade às drogas sistematicamente entregues, representam os principais alvos para o desenvolvimento de drogas1. Consequentemente, as proteínas extracellular representam mais de 70% das metas de proteína com ação farmacológica conhecido por drogas aprovadas no mercado, conhecido como o "proteome druggable". Apesar da sua importância e abundância, as redes de interação (ePPI) da proteína-proteína extracelular permanecem notavelmente sub-representados nos bancos de dados disponíveis. Isto é, fundamentalmente, devido à natureza complexa bioquímica das proteínas extracelulares, que impede a sua caracterização usando mais disponíveis tecnologias2. Em primeiro lugar, as proteínas de membrana são difíceis de solubilizar, um processo que muitas vezes envolve lavagem duras condições e detergentes; em segundo lugar, as proteínas extracellular faltam frequentemente relevantes modificações borne-translational como glicosilação que estão ausentes quando estas proteínas são expressas em comumente utilizados sistemas heterólogos. Finalmente, interações entre receptores, tais como co receptores expressados em células do sistema imunológico, são muitas vezes transitórios e caracterizada por afinidades muito baixas (KD no ~ 1 μM para > intervalo de 100 μM). No total, a natureza destas proteínas e sua vinculação parceiros processam mais amplamente utilizadas tecnologias, tais como espectrometria de massa/purificação de afinidade (AP/MS) ou fermento-dois-híbrido, impróprio para a deteção das interações no espaço extracelular 2 , 3.
Em um esforço para superar esses desafios técnicos e acelerar a descoberta de novas interações para proteínas extracelulares, desenvolvemos uma cobertura alta proteína extracelular microarray4,5. Microarrays oferecem a vantagem de gerar superfícies de alta densidade com pequenas quantidades de amostra e são geralmente favoráveis aos estudos de alto rendimento. Proteína microarray baseado em estudos anteriormente forneceu insights relevantes sobre interações da proteína por vários organismos-modelo, embora concentrando-se principalmente no citosol interações ou na proteína específica famílias6,7, 8. Em contraste, limitado de trabalho tem sido feito para investigar interações de proteínas extracelulares usando esta tecnologia. Nós desenvolvemos um método de microarray da proteína para permitir estudos de ePPIs através da construção de uma biblioteca abrangente e altamente diversa de proteínas purified segregadas e único receptores transmembranares de (STM) expressaram como recombinação domínios extracelulares (ECD) fundidos a tags comuns para afinidade purificação4. O sucesso das telas do microarray da proteína baseia-se fortemente sobre a criação de uma biblioteca de proteína de alta qualidade. Para a expressão da proteína de biblioteca e consulta, nas células de mamíferos ou insetos foram preferencialmente escolhidos como sistemas de expressão heteróloga, para garantir a adequada adição de modificações borne-translational como glicosilação ou dissulfureto de títulos. SDS-PAGE, cromatografia de exclusão e espalhamento de luz laser de multi-ângulo são técnicas comumente utilizadas para avaliar a qualidade da proteína recombinante. A biblioteca de proteína é então manchada em epoxysilane slides e armazenada a-20 ° C para uso a longo prazo. As concentrações de proteína acima de 0,4 mg/mL são recomendadas para o protocolo descrito abaixo. Portanto, baixa-expressando proteínas podem exigir uma etapa de concentração antes da impressão de amostra e armazenamento. No entanto, a principal vantagem desta técnica é o pequeno volume de proteína necessária (50 μg de proteína é suficiente para executar > 2.000 telas), juntamente com o consumo de proteína de consulta mínima (20-25 μg por tela de duplicatas). Usando o protocolo e o equipamento descrito aqui, e desde que as bibliotecas estão disponíveis, resultados para proteínas de consultas individuais podem ser gerados dentro de um dia de trabalho.
Um grande desafio na detecção de interações da proteína no meio extracelular decorre sua natureza caracteristicamente fraca ou transitória, que impede a identificação por metodologias mais comumente usadas. A avidez de vinculação a aumentar grandemente melhora a sensibilidade para a deteção de proteínas fracas interações9,10,11. Baseado neste princípio que desenvolvemos um método para multimerize as proteínas de consulta (expressadas como fusão Fc) usando a proteína grânulos revestidos A4,5. Para evitar qualquer potencial inactivação da proteína consulta pela rotulagem aleatória, nós em vez disso rotular uma irrelevante a imunoglobulina humana G com Cy5 e adicioná-lo juntamente com a proteína de consulta para os grânulos de proteína A, eliminando assim qualquer artefatos devido a conjugação direta de um tintura à proteína de interesse. Tendo em conta as afinidades micromolar de vários pares de co do receptor, os complexos multivalentes aumentar consideravelmente o sinal à relação de ruído, em comparação com proteínas da consulta Fc-fusão selecionadas como proteínas solúveis4.
Em resumo, o objetivo do presente protocolo é descrever a preparação de microarray slides contendo uma biblioteca de proteína extracelular pré-existentes para identificação de interações ligante-receptor. Revemos as etapas para slide, impressão, seguido por um protocolo para a seleção de uma proteína de interesse contra a biblioteca de proteína extracelular. Além disso, descrevemos um método para a detecção avançada de ePPIs baseada microbeads para alcançar maior avidez da proteína em estudo. A tecnologia de microarray de proteína extracelular descrita aqui representa uma abordagem rápida, robusta e eficaz para a seleção e detectando ePPI romance com baixos índices de falso-positivos e utilizando apenas as quantidades de microgramas da proteína sob consulta investigação. Esta tecnologia tem alimentado vários estudos que forneceram insights relevantes sobre previamente desconhecida de funções celulares e vias de sinalização para uma variedade de receptores12,13, incluindo immunoregulators viral14, e pode ser utilizado para orphanize de qualquer extracelular da proteína de interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

Fatores secretados, receptores de membrana-amarrados e seus parceiros de interação são os principais reguladores da comunicação celular e início de cascatas de sinalização durante a homeostase e a doença e como tal representam alvos terapêuticos. Apesar de sua relevância, estas redes de interação permanecem significativamente sub-representados em bancos de dados atuais; Portanto, mais proteínas extracelulares não tem nenhum parceiro de vinculação documentada. Esta discrepância deve-se principalmente os desafios associados com o estudo das proteínas extracelulares, incluindo a expressão de proteínas funcionais e a fraca, baixa afinidade, interações proteína frequentemente estabelecidas entre receptores de superfície celular. A finalidade desse método é descrever a impressão de uma biblioteca de proteínas extracelulares em um formato de microarray para rastreio de interações da proteína-proteína. Para habilitar a detecção de interações fracas, é descrito um método baseado na multimerization da proteína consulta sob estudo. Acoplado a essa abordagem baseada em Microconta multimerization para multivalency de aumento, o microarray da proteína permite a detecção robusta de interações da proteína-proteína transitória em alta taxa de transferência. Este método oferece uma amostra rápida e baixo consumo-abordagem para identificação de novas interações aplicáveis para qualquer proteína extracelular. Impressão de microarray de proteína e protocolo de triagem são descritos. Esta tecnologia será útil para os investigadores procuram um método robusto para descoberta de interações da proteína no espaço extracelular.

Um diagrama de fluxo de trabalho para a tecnologia de microarray de proteína extracelular é mostrado na Figura 1. Uma vez que os slides de microarray que contém a biblioteca de proteína extracelular estão disponíveis, o rastreio da proteína de interesse e análise de dados pode ser concluído dentro de um dia. Muitas interações fisiologicamente relevantes entre os receptores de membrana-incorporado são caracterizadas por forças de ligação muito f...

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Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das interações proteicas, permitindo a detecção de novos parceiros de ligação para proteínas extracelulares, tanto em alto rendimento quanto com alta sensibilidade. A principal vantagem deste método é que, com apenas alguns microgramas de proteína, você pode gerar centenas de slides usando a impressora micro array. Use um micro arrayer padrão para impressão de slides.Este instrumento tem capacidade para 57 slides por corrida, usa uma cabeça de impressão com 48 pinos de manchas e pode acomodar até 8.000 pontos por slide. Gere placas de trabalho utilizando 384 placas de poço a 10 microliters de amostra por poço a partir das placas de estoque. Execute esta etapa manualmente, antes de deslizar usando o micro arrayer.Em seguida, localizam proteínas com pinos de manchas tipo pena em lâminas de silano epóxi a 60% de umidade para evitar a desidratação das manchas proteicas. A albumina de soro bovino círio cy3 pode ser vista em duplicata entre cada amostra de proteína para visualizar a matriz para a montagem da máscara. Após a impressão, remova os slides da micro matriz de proteínas do ambiente umidificado.Em seguida, use um fogger ultrassônico para gerar uma fina névoa de solução de bloqueio que se instala na superfície do slide. Em seguida, bloqueie os slides durante a noite com 5% de leite no PBST para promulgar a superfície. Armazene slides a menos 20 graus Celsius em 50% de glicerol para evitar congelamento.Interações entre proteínas extracelulares são muitas vezes caracterizadas por suas baixas afinidades. Para permitir a detecção dessas interações, aumentando a avidez vinculante, desenvolvemos uma abordagem multivalente baseada na captura da proteína queried expressa como domínios extracelulares marcados pelo FC em micro contas revestidas de proteína A. Gire o IgG portador, que foi rotulado com corante mono reativo Cy5, conforme descrito no protocolo de texto.Para calcular a razão molar da proteína de consulta e Cy5 IgG, divida o peso molecular da proteína de consulta pelo peso molecular do IgG e multiplique por 40 microgramas por mililitro para determinar a concentração de Cy5 IgG necessária. Uma vez que todas as proporções tenham sido determinadas formam o complexo de proteína de micro contas combinando a consulta marcada fc e o Cy5 IgG com a proteína A micro contas. Misture a suspensão em PBS em um rotador de tubo por 30 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz.Para começar a triagem, aqueça os slides preparados à temperatura ambiente antes de carregar para a estação de hibridização. Para realizar a triagem, primeiro lave a micro matriz com PBST por um minuto para remover glicerol residual. Carregue 200 microlitadores de um miligrama por mililitro de proteína A em PBS 5% de leite e incubar por 30 minutos para prevenir proteínas não complexas Uma micro contas de ligação com proteínas marcadas pela FC que podem estar presentes na micro matriz.Após a estação de hibridização lavar os slides com PBST, carregue 200 microlitadores do complexo de micro contas de consulta, na presença de um miligrama por milliliter protein A e incubar por 30 minutos. Após a hibridização e lavagem dos slides pela estação de hibridização, enxágue lâminas com água e coloque-as em tubos cônicos individuais de 50 mililitros. Seque os tubos girando a 900 vezes G por cinco minutos.Finalmente, escaneie os slides com um scanner de micro array apropriado para detectar fluorescência Cy3 e Cy5, excitando em 532 e 635 nanômetros, respectivamente. Mostrado aqui é uma imagem representativa de um slide impresso. Os pontos de albumina de soro bovino rotulados cy3 estão em verde.As manchas foram impressas em duplicata como controle de qualidade do processo de impressão. Resultados representativos de uma proteína órfã, rastreada para identificação de parceiros de ligação usando a tecnologia de micro array de proteína extracelular, são mostrados aqui. As manchas vermelhas duplicadas são identificadas como um sucesso para a proteína de consulta tela.Este método que é descrito é altamente versátil e pode ser usado para a impressão de uma gama de bibliotecas proteicas, sejam elas famílias de proteínas específicas ou grandes compilações de proteínas como a nossa. Qualquer proteína de interesse pode ser avaliada. Ao tentar este procedimento é importante manusear os slides com cuidado e garantir que eles não sequem de modo a evitar a perda de atividade das proteínas impressas.Seguindo a tela de uma proteína de interesse, é altamente aconselhável validar ainda mais quaisquer hits observados usando tecnologias ortogonais, como ressonância de plasmon superficial. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores estudarem interações proteicas extracelulares em humanos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Bioquímica

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Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Experimentos de RMN de alta pressão para detectar estados conformais de baixa mentira de proteína

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Otimização dos Parâmetros de Classificação por Citometria de Fluxo para Isolamento de Alto Rendimento e Purificação de Pequenas Vesículas Extracelulares

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Cristalização de proteínas de alto rendimento via microdiálise

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...