Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Мы благодарим Philamer Calses и Юн Кобе за критически читать рукопись. Мы благодарны Рэнди иен за отличные технические консультации.

1. Генерация библиотеки внеклеточных белков человека
<ol><li>Составить список поверхности рецепторы клеток или секретируемые белки, представляющие интерес для построения библиотеки microarray протеина. Конкретные белка семьи (например, Иммуноглобулин надсемейства) или белки выборочно выра?...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

Значительное число сирот рецепторов остается в геноме человека, и Роман взаимодействующих партнеры продолжают появляться внеклеточных белков с ранее характеризуется лигандами. Определение рецептор лиганд взаимодействия человека и модельных организмов необходимо понять механизмы, ...

Метод, рассмотрели здесь описывает печать коллекции внеклеточных белков в формате microarray дна, а затем с помощью метода для проверки целевого интерес против этой библиотеки. Мы выявили белок multimerization как решающий шаг для обнаружения взаимодействий, характеризуются низкой привязки сродства. Для улучшения обнаружения этих взаимодействий, мы описываем протокол, основанный на multimerization запроса протеина интереса, используя микрошарики.
Выделяется и клеток выражена поверхности белки (собирательно именуются внеклеточные белки) наряду с их взаимодействия партнеров являются ключевые регуляторы сотовой связи, сигнализации и взаимодействия с микроокружения. Таким образом, они имеют важное значение в регуляции многих физиологических и патологических процессов. Около четверти генома человека (≈5, 000 белки) кодирует внеклеточных белков, который, учитывая их важность и доступность для систематически поставляемых наркотиков, представляют собой ключевые цели развития наркотиков1. Следовательно внеклеточные белки представляют более чем 70% белковых мишеней с известных фармакологических действий для утвержденных лекарств на рынке, известный как «druggable протеом». Несмотря на их важность и изобилия внеклеточный протеин взаимодействия (ePPI) сетей по-прежнему удивительно недопредставлены в доступных баз данных. Это принципиально ввиду сложных биохимических внеклеточных белков, который исключает их характеристик с помощью самых доступных технологий2. Во-первых мембранные белки трудны для того солюбилизировать последнего, процесс, который часто включает в себя тяжелые Стиральная условий и моющих средств; Во-вторых внеклеточные белки часто не хватает соответствующих столб-поступательные изменения таких как гликозилирования, отсутствуют когда эти белки выражаются в часто используемые гетерологичных систем. Наконец, взаимодействие между рецепторов, таких как сопредседатель рецепторов, выраженные на иммунные клетки, часто переходных и характеризуется очень низкой работоспособностью (D K в ~ 1 мкм для > 100 мкм диапазон). В общей сложности характер этих белков и их привязки, которые партнеры оказывают наиболее широко используемых технологий, таких как сродства очищения/масс-спектрометрии (AP/МС) или дрожжи 2 гибрида, непригодных для обнаружения взаимодействий в пространстве внеклеточного 2 , 3.
В попытке преодолеть эти технические проблемы и ускорить открытие новых взаимодействий для внеклеточных белков мы разработали высокий охват внеклеточный протеин microarray дна4,5. Microarrays предлагают преимущество создания высокой плотности поверхности с небольшим количеством образца и обычно поддаются исследования высокой пропускной способности. Исследования на основе microarray протеина ранее предоставили соответствующие понимание взаимодействия протеина для нескольких модельных организмов, хотя главным образом на цитозольной взаимодействия или на конкретных белка семьи6,7, 8. В отличие от ограниченных была проделана расследовать внеклеточный протеин взаимодействия с использованием этой технологии. Мы разработали метод microarray протеина для включения исследований ePPIs путем создания всеобъемлющего и весьма разнообразных библиотека очищенного секретируемые белки и одного трансмембранные рецепторы (СТМ) выражена как рекомбинантной внеклеточных доменов (ECD) сливается с общие теги для очищения сродства4. Успех на экранах microarray протеина опирается на создание высокого качества белка библиотеки. Для выражения запроса, так и библиотека белка mammalian клетки или клетки, насекомых преференциально были выбраны как гетерологичных выражение системы, для обеспечения правильного сложения столб-поступательные изменения таких облигаций гликозилирования или дисульфида. SDS-PAGE, размер гель-проникающей хроматографии и мульти-угол лазерного рассеяния света являются методы обычно используются для оценки качества рекомбинантных белков. Белка библиотека затем увидел на epoxysilane слайды и температуре-20 ° C для долгосрочного использования. Концентрация белка выше 0,4 мг/мл рекомендуются для протокола, описанных ниже. Таким образом низкий выражая белков может потребовать концентрации шаг до печати выборки и хранения. Тем не менее, основным преимуществом этого метода является небольшой объем белка требуется (50 мкг белка достаточно выполнить > 2000 экраны), наряду с минимальным запроса потребление белка (20-25 мкг за дубликаты экран). С использованием протокола и оборудования описано здесь, и если имеются библиотеки, результаты для отдельных запросов белки могут быть получены в течение одного рабочего дня.
Одной из основных задач при выявлении взаимодействий протеина в внеклеточных среды вытекает из их характерно слабое или временный характер, что исключает возможность идентификации, наиболее часто используемых методологий. Расширения привязки алчность значительно улучшает чувствительность для обнаружения слабых белковых взаимодействий9,10,11. Основываясь на этом принципе, мы разработали метод multimerize запроса белки (выражается как ФК fusion) с помощью белка A-покрытием бусины4,5. Чтобы избежать любой потенциальной инактивации белка запроса путем случайных маркировки, мы вместо этого метка не значения человеческого иммуноглобулина G с Cy5 и добавить его вместе с запроса белка белка А бусы, таким образом устраняя любые артефакты из-за прямого сопряжения краситель для протеина интереса. С учетом всех сходство несколько пар ко-рецептор, разносторонним комплексы значительно повысить соотношение сигнал-шум, по сравнению с Fc фьюжн запросов белки показан как растворимые белки4.
Таким образом цель настоящего Протокола является описать подготовку microarray слайды, содержащий существующие библиотеки внеклеточный протеин для идентификации рецептор лиганд взаимодействий. Мы рассмотрим шаги, необходимые для печати, а затем протокол для скрининга протеина интереса против внеклеточных белков библиотеки слайдов. Кроме того мы описываем метод расширения обнаружения ePPIs на основании микрошарики для достижения увеличения алчность белка изучается. Описанная здесь технология microarray внеклеточный протеин представляет собой быстрый, надежный и эффективный подход для скрининга и выявления роман ePPI с низким коэффициентом ложно положительных и, используя только микрограмм количеств белка запроса под расследование. Эта технология подпитывается несколько исследований, которые предоставили соответствующие взглянуть на ранее неизвестных клеточных функций и сигнальных путей для различных рецепторов12,13, включая вирусный immunoregulators14, и может быть использован для снятия orphanize любой внеклеточный протеин интереса.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

Выделяется факторы, мембрана привязанный рецепторов и их взаимодействия партнеров являются основными регуляторами сотовой связи и начало сигнальные каскады во время гомеостаза и болезней и как таковые представляют собой премьер терапевтических целей. Несмотря на их актуальности эти сети взаимодействия по-прежнему значительно недопредставлены в текущих базах данных; Таким образом наиболее внеклеточных белков у партнера не документированы привязки. Это расхождение обусловлено прежде всего проблемы, связанные с изучением внеклеточных белков, включая выражение функциональных белков и слабый, низкий сродство, взаимодействий протеина, часто создаваемых между поверхности рецепторы клеток. Этот метод предназначен для описания печать библиотеки внеклеточных белков в формате microarray для скрининга белок белковых взаимодействий. Чтобы включить обнаружение слабых взаимодействий, описан метод, основанный на multimerization белка запроса под исследование. Связан этот подход на основе microbead multimerization для увеличения поливалентность, microarray протеина позволяет надежного обнаружения переходных белок белковых взаимодействий в высокой пропускной способности. Этот метод предлагает пример быстрого и низкого потребления подход для идентификации новых взаимодействий, применимым к любой внеклеточных белков. Описаны протеина microarray печати и скрининга протокол. Эта технология будет полезным для следователей, ищущих надежный метод для обнаружения белковых взаимодействий в внеклеточного пространства.

Схема рабочего процесса для технологии microarray внеклеточный протеин показан на рисунке 1. После того, как слайды microarray дна, содержащий библиотеку внеклеточных белков доступны, скрининг протеина интереса и анализ данных может быть завершена в течение одн...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Здесь мы представляем протокол для экрана внеклеточный протеин microarrays для идентификации Роман рецептор лиганд взаимодействий в высокой пропускной способности. Мы также описывают метод для улучшения обнаружения переходных белок белковых взаимодействий с помощью белка microbead комплексов.

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия белкового белка, позволяя обнаруживать новых связывающих партнеров для внеклеточных белков, как при высокой пропускной способности, так и с высокой чувствительностью. Основным преимуществом этого метода является то, что, с помощью всего лишь нескольких микрограммов белка, вы можете генерировать сотни слайдов с помощью принтера микро массива. Используйте стандартный микро массивер для слайд-печати.Этот инструмент имеет емкость 57 слайдов на пробег, использует печатаную головку, держащую 48 пятнистых булавок, и может вместить до 8000 пятен на слайд. Создайте рабочие пластины с использованием 384 пластин на 10 микролитров образца на колодец из фондовых пластин. Выполните этот шаг вручную, перед слайд-печатью с помощью микро массивера.Затем месте белков с пером типа пятнистость булавки на эпоксидной силан слайды на 60% влажности, чтобы предотвратить обезвоживание белковых пятен. Cy3 помечены бычьей сыворотки альбумин могут быть замечены в дубликате между каждым образцом белка, чтобы визуализировать массив для маски установки. После печати удалите слайды микро массива белка из увлажненной среды.Далее используйте ультразвуковой противотуманной для создания тонкого тумана блокирующего раствора, который оседает на поверхности слайда. Затем, блокировать слайды на ночь с 5%молока в PBST для enactivate поверхности. Хранить слайды при температуре минус 20 градусов по Цельсию в 50%глицерола, чтобы предотвратить замораживание.Взаимодействия между внеклеточными белками часто характеризуются их низким сродством. Чтобы обеспечить обнаружение этих взаимодействий, увеличивая связывающую алчность, мы разработали многовалентный подход, основанный на захвате запрошенного белка, выраженного как FC помеченные внеклеточные домены на белке A с покрытием микро шариков. Спин перевозчика IgG, который был помечен с Cy5 моно реактивный краситель, как описано в текстовом протоколе.Чтобы вычислить молярное соотношение белка запроса и Cy5 IgG, разделите молекулярный вес белка запроса на молекулярный вес IgG и умножьте на 40 микрограмм на миллилитр, чтобы определить концентрацию необходимой Cy5 IgG. После того, как все соотношения были определены форме микро бисер белка комплекса путем объединения FC помечены запрос и Cy5 IgG с белком микро шарики. Смешайте подвеску в PBS на трубчатом ротаторе в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света.Чтобы начать скрининг, разогреть подготовленные горки при комнатной температуре перед погрузкой на станцию гибридизации. Для проведения скрининга сначала смойте микро массив с помощью PBST в течение одной минуты, чтобы удалить остаточный глицерол. Загрузите 200 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр белка А в PBS 5%молока и инкубировать в течение 30 минут, чтобы предотвратить несогласоваемый белок микробусы от связывания с белок с тегами FC, которые могут присутствовать в микро массиве.После гибридизации станция моет горки с помощью PBST, загружает 200 микролитров микро шарикового комплекса запроса, в присутствии одного миллиграмма на миллилитр белка А и инкубирует в течение 30 минут. После гибридизации и мытья горок на станции гибридизации, промыть горки водой и поместить их в отдельных 50 миллилитров конических труб. Высушите трубки, вращаясь на 900 раз G в течение пяти минут.Наконец, сканируйте слайды с помощью микро-сканера массива, подходящего для обнаружения флуоресценции Cy3 и Cy5 с помощью захватывающих на 532 и 635 нанометров, соответственно. Здесь показано репрезентативное изображение печатного слайда. Cy3 помечены бычьей сыворотки альбумин пятна в зеленом цвете.Пятна были напечатаны дубликатом в качестве контроля качества процесса печати. Здесь показаны репрезентативные результаты осиротевшего белка, скрининг для идентификации связывающих партнеров с использованием технологии внеклеточного белкового микро массива. Двойные красные пятна идентифицируются как хит для экранируемого белка запроса.Этот метод, который описывается является весьма универсальным и может быть использован для печати гамму белковых библиотек, будь то конкретные семьи белков или большие сборники белков, таких как наша. Любой белок, представляющий интерес, может быть оценен. При попытке этой процедуры важно обращаться с слайдами с осторожностью и убедиться, что они не высыхают, с тем чтобы предотвратить потерю активности напечатанных белков.После экрана белка, представляющих интерес, настоятельно рекомендуется для дальнейшей проверки любых хитов наблюдается с помощью ортогональных технологий, таких как поверхностный плазмонный резонанс. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей для изучения внеклеточных белков взаимодействий в организме человека.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Простая, прочная и высокая пропускная способность одной молекулы потока растяжения Assay осуществления для изучения транспорт молекул вдоль ДНК

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Эксперименты ямР высокого давления для обнаружения белковых низколежащих конформационных состояний

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Анализ флуоресценции кальция с двойным добавлением для высокопроизводительного скрининга рекомбинантных рецепторов, связанных с G-белком

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Оптимизация параметров проточной цитометрической сортировки для высокопроизводительной изоляции и очистки малых внеклеточных везикул

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Высокопроизводительная кристаллизация белка с помощью микродиализа

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...