Name: extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Vi tackar Philamer Calses och Kobe Yuen för att kritiskt läsa manuskriptet. Vi är tacksamma till Randy Yen för utmärkt teknisk rådgivning.

1. generering av ett bibliotek av extracellulära mänskliga proteiner
<ol><li>Sammanställa en lista över ytan cellreceptorer eller utsöndras proteiner av intresse att bygga protein microarray biblioteket. Specifikt protein familjer (till exempel immunglobulin överfamiljen) eller proteiner uttryckte selektivt i synnerhet cell typer kan väljas för studien.</li>
	<li>För surface cellreceptorer, bestämma extracellulär (ECD) domängränser genom att identifiera de signal peptid och transmembrana regioner med hjäl...

<ol>
	<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li><li>Ramani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+microarray+platform+for+extracellular+protein+interaction+discovery.">A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery.</a> Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).</li><li>Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+for+identification+of+novel+extracellular+protein-protein+interactions.">Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).</li><li>Kaushansky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein-protein+interactions+in+high+throughput+using+protein+domain+microarrays.">Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays.</a> Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).</li><li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays.">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li><li>Voulgaraki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).</li><li>Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+Binds+to+Apolipoproteins,+Including+APOE+and+CLU/APOJ,+and+Thereby+Facilitates+Uptake+of+Amyloid-Beta+by+Microglia.">TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia.</a> Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).</li><li>Jaworski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+redundancy+in+axon+guidance+through+the+multifunctional+receptor+Robo3+and+its+ligand+NELL2.">Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2.</a> Science. 350 (6263), 961-965 (2015).</li><li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+interactome+of+the+human+adenovirus+family+reveals+diverse+strategies+for+immunomodulation.">The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation.</a> Nature Communications. 7, 11473 (2016).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Secretory+Proteins+with+SignalP.">Predicting Secretory Proteins with SignalP.</a> Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+Markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes.</a> Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).</li><li>Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+combined+transmembrane+topology+and+signal+peptide+prediction--the+Phobius+web+server.">Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).</li><li>Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOPCONS:+consensus+prediction+of+membrane+protein+topology.">TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology.</a> Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).</li><li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+the+mammalian+extracellular+proteome+for+regulators+of+embryonic+human+stem+cell+pluripotency.">Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).</li><li>Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+mammalian+protein+expression,+purification,+aliquoting+and+storage+pipeline+to+assemble+a+library+of+the+human+secretome.">A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).</li><li>Clark, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secreted+protein+discovery+initiative+(SPDI),+a+large-scale+effort+to+identify+novel+human+secreted+and+transmembrane+proteins:+a+bioinformatics+assessment.">The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.</a> Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).</li></ol>

Ett betydande antal föräldralösa receptorer kvar i det mänskliga genomet, och romanen samverkande parter fortsätta växa fram för extracellulära proteiner med tidigare kännetecknas ligander. Definiera den receptor-ligand interaktioner i mänskliga och modellorganismer är viktigt att förstå de mekanismer som dikterar cellulär kommunikation under homeostas, liksom dysreglering leder till sjukdom, och därför informera nya eller förbättrade terapeutiska alternativ. Dock har upptäckt av extracellulära protei...

Metoden ses här beskrivs utskrift av en samling av extracellulära proteiner i en microarray format, följt av en metod för screening av ett mål av intresse mot detta bibliotek. Vi har identifierat protein multimerization som ett avgörande steg för detektion av interaktioner som kännetecknas av låg bindande samhörighet. För att förbättra identifiering av interaktionerna, beskriver vi ett protokoll baserat på multimerization av proteinet frågan av intresse med mikrokulor.
Utsöndras och cell surface-uttryckta proteiner (kollektivt kallas extracellulära proteiner) tillsammans med sina samverkande partner är viktiga regulatorer av cellulär kommunikation, signalering och interaktion med mikromiljö. De är därför viktiga i regleringen av många fysiologiska och patologiska processer. Ungefär en fjärdedel av det mänskliga genomet (≈5, 000 proteiner) kodar för extracellulära proteiner, som, med tanke på deras betydelse och tillgänglighet till systematiskt levererade droger, representerar viktiga mål för drogen utveckling1. Följaktligen utgör extracellulära proteiner mer än 70 procent av de protein mål med kända farmakologiska verkan för godkända läkemedel på marknaden, känd som det ”druggable proteomet”. Trots sin betydelse och överflöd fortfarande de extracellulära protein-protein interaktioner (ePPI) nätverk anmärkningsvärt underrepresenterade i de tillgängliga databaserna. Detta är i grunden på grund av komplexa biokemiska karaktär av extracellulära proteiner, vilket utesluter deras karakterisering som använder mest tillgängliga teknik2. För det första är membranproteiner svåra att solubilize, en process som ofta innebär hårda tvätt villkor och rengöringsmedel; för det andra saknar extracellulära proteiner ofta relevant post-translationella modifieringar såsom glycosylation som är frånvarande när dessa proteiner uttrycks i vanligen används heterologa system. Slutligen, interaktioner mellan receptorer som samtidig receptorer uttrycks på immunceller, är ofta övergående och kännetecknas av mycket låg affinitet (K-D i den ~ 1 μM till > 100 μM utbud). Alldeles, arten av dessa proteiner och deras bindning partners göra mest utnyttjade teknik, såsom affinitet rening/masspektrometri (AP/MS) eller jäst-två-hybrid, olämpliga för detektion av interaktioner i extracellulära 2 , 3.
I ett försök att övervinna dessa tekniska utmaningar och påskynda upptäckten av nya interaktioner för extracellulära proteiner, har vi utvecklat en hög täckning extracellulära protein microarray4,5. Microarrays fördelen med generera hög densitet ytor med små mängder prov och är allmänt mottagliga för hög genomströmning studier. Protein microarray-baserade studier har tidigare lämnat relevanta insikter proteininteraktioner för flera modellorganismer, om än främst fokusera på cytosoliska interaktioner eller specifikt protein familjer6,7, 8. Däremot har begränsad arbete gjorts för att undersöka extracellulära proteininteraktioner med denna teknik. Vi har utvecklat en protein microarray metod för att möjliggöra studier av ePPIs genom att bygga ett omfattande och mycket olikartade bibliotek av renade proteiner från utsöndras och enda transmembrana (STM) receptorer uttrycks som rekombinant extracellulära domäner (ECD) smält till vanliga taggar för affinitet rening4. Framgången för protein microarray skärmarna är starkt beroende av inrättandet av en hög kvalitet protein library. Uttryck för både bibliotek och fråga protein valdes däggdjursceller eller insekt celler prioriterat som heterologa uttryck system, att säkerställa korrekt tillägg av post-translationella modifieringar som glycosylation eller disulphide obligationer. SDS-PAGE, storlek utslagning kromatografi och flera vinklar laserljus spridning är tekniker som ofta används för att bedöma rekombinant proteinkvalitet. Protein biblioteket sedan fläckig på epoxysilane bilder och lagras vid-20 ° C för långvarig användning. Protein koncentrationer över 0,4 mg/ml rekommenderas för det protokoll som beskrivs nedan. Låg-uttryckande proteiner kan därför kräva en koncentration steg före provet utskrift och lagring. En största fördelen med denna teknik är dock den lilla volymen av protein krävs (50 μg av protein är tillräckligt att utföra > 2.000 skärmar), tillsammans med minimal fråga protein konsumtion (20-25 μg per dubbletter skärm). Med hjälp av protokoll och utrustning som beskrivs här, och förutsatt att biblioteken är tillgängliga, resultat för enskilda fråga proteiner kan genereras inom en arbetsdag.
En stor utmaning i att upptäcka proteininteraktioner i den extracellulära miljön uppstår från deras egenskapt svag eller övergående natur, vilket utesluter identifiering av de vanligaste metoderna. Öka den bindande aviditet kraftigt förbättrar känsligheten för upptäckt av svag protein interaktioner9,10,11. Baserat på denna princip som vi utvecklat en metod att multimerize frågan proteinerna (uttryckt som Fc fusion) använder protein A-belagd pärlor4,5. För att undvika eventuella potentiella inaktivering av proteinet fråga av slumpmässiga märkning, vi istället etikett en irrelevant humant immunglobulin G med Cy5 och Lägg tillsammans med proteinet fråga till protein A pärlorna, vilket eliminerar alla artefakter på grund av den direkta konjugering av en färga till proteinet av intresse. Med tanke på de mikromolära tillhörighet av flera samtidig receptor par, öka de multivalenta komplex kraftigt signal-brus-förhållande, jämfört med Fc-fråga fusionsproteinerna screening som lösliga proteiner4.
Sammanfattningsvis är syftet med detta protokoll att beskriva utarbetandet av microarray bilder som innehåller ett befintligt extracellulära protein bibliotek för identifiering av receptor-ligand interaktioner. Vi granskar stegen för bild utskrift, följt av ett protokoll för screening av ett protein av intresse mot den extracellulära protein library. Dessutom beskriver vi en metod för förbättrad detektion av ePPIs baserat på mikrokulor att uppnå ökade aviditet av protein under studien. Den extracellulära protein Mikroarrayteknik beskrivs här representerar en snabb, robust och effektiv metod för screening och upptäcka nya ePPI med låg falskt positiva förhållanden och genom att utnyttja bara mikrogram kvantiteter av proteinet fråga under utredning. Denna teknik har underblåst flera studier som har gett relevanta insikter om tidigare okända cellfunktioner och signalvägar för en mängd olika receptorer12,13, inklusive viral immunoregulators14, och kan utnyttjas för att de orphanize något extracellulära protein av intresse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ultra Pure MB Grade glycerol</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeptoMark blocking buffer&#160;</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>BB1, 90-40</td>
			<td>Blocking buffer microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03-117-957-001</td>
			<td>Slide control for mask fitting (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>82050-678</td>
			<td>Protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene multiwell plates</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>MMP384</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Arrayit</td>
			<td>Micro spotting pins</td>
			<td>Slide printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeptoFOG blocking station</td>
			<td>Zeptosens</td>
			<td>ZeptoFOG blocking station, 1210</td>
			<td>Block slides after printing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxysilane-coated glass slide</td>
			<td>Nextrion Slide E</td>
			<td>1064016</td>
			<td>Microarray slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass holder and slide rack set</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>900303</td>
			<td>Slide storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>Albumin labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 monoreactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA25001</td>
			<td>Human IgG labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-spin desalting column</td>
			<td>Princeton Separations</td>
			<td>CS-800</td>
			<td>Remove free dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive aluminum foil seal</td>
			<td>AlumaSeal</td>
			<td>F-384-100</td>
			<td>Seal stock plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430658</td>
			<td>Master vials for protein library storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>120-000-396</td>
			<td>Query protein multimerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>&#160;009-000-003</td>
			<td>Irrelevant IgG for labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P7837</td>
			<td>Microarray slide blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>Hybridization station, a-Hyb or similar</td>
			<td>Automated microarray processing (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix 4000B scanner or similar</td>
			<td>Slide scanning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>GenePix Pro or equivalent data extraction software</td>
			<td>Data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal P4.1</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHMM 2.0 server</td>
			<td>DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of transmembrane helices in proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phobius</td>
			<td>Stockholm Bioinformatics Center</td>
			<td>online software</td>
			<td>A combined transmembrane topology and signal peptide predictor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPCONS</td>
			<td>Stockholm University</td>
			<td>online software</td>
			<td>Prediction of membrane topology and signal peptides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular protein microarray technology for high throughput detection of low affinity receptor-ligand interactions

Utsöndrade faktorer, membran-bundna receptorer och deras samverkande partner är huvudsakliga regulatorer av cellulär kommunikation och inledande av signalering cascades under homeostas och sjukdom, och som sådan utgör främsta terapeutiska mål. Trots deras relevans fortfarande dessa interaktion nätverk kraftigt underrepresenterade i aktuella databaser; Därför har mest extracellulära proteiner ingen dokumenterad bindande partner. Denna skillnad beror främst på de utmaningar som förknippas med studien av de extracellulära proteiner, inklusive uttryck av funktionella proteiner och svag, låg affinitet, proteininteraktioner upprättas vanligtvis mellan surface cellreceptorer. Syftet med denna metod är att beskriva utskrift av ett bibliotek av extracellulära proteiner i en microarray format för screening av protein-protein interaktioner. För att aktivera identifiering av svaga interaktioner, beskrivs en metod baserad på multimerization av proteinet fråga under studien. Kopplat till denna microbead-baserade multimerization strategi för ökad multivalency, kan det protein microarray robust övergående protein-protein interaktioner i hög genomströmning. Denna metod erbjuder en snabb och låg prov konsumerar-metod för identifiering av nya interaktioner tillämpliga på något extracellulära protein. Protein microarray utskrift och screening protokoll beskrivs. Denna teknik kommer att vara användbart för utredare söker en robust metod för upptäckt av proteininteraktioner i det extracellulära utrymmet.

En schematisk i arbetsflödet för den extracellulära protein Mikroarrayteknik visas i figur 1. När microarray bilder som innehåller den extracellulära protein library är tillgängliga, kan screening av proteinet av intresse och dataanalys slutföras inom en dag. Många fysiologiskt relevanta interaktioner mellan membran-embedded receptorer kännetecknas av mycket svag bindande styrkor (KD i intervallet mikromolära). För att förbättra iden...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Här presenterar vi ett protokoll till skärmen extracellulära protein microarrays för identifiering av romanen receptor-ligand interaktioner i hög genomströmning. Vi beskriver också en metod för att förbättra identifiering av övergående protein-protein interaktioner med protein-microbead komplex.

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom proteinproteininteraktioner genom att möjliggöra detektion av nya bindande partners för extracellulära proteiner, både i hög genomströmning och med hög känslighet. Den största fördelen med denna metod är att du, med bara några mikrogram protein, kan generera hundratals diabilder med hjälp av mikromatrisskrivaren. Använd en standardmikromatris för bildutskrift.Detta instrument har en kapacitet på 57 diabilder per körning, använder ett skrivhuvud som håller 48 spotting stift, och kan rymma upp till 8,000 fläckar per bild. Generera arbetsplattor med hjälp av 384 brunnsplattor vid 10 mikroliter prov per brunn från lagerplattorna. Utför det här steget manuellt, före bildutskrift med hjälp av micro arrayer.Sedan upptäcka proteiner med quill typ spotting stift på epoxi silan diabilder på 60% luftfuktighet för att förhindra uttorkning av proteinfläckar. Cy3 märkt bovint serum albumin kan upptäckas i duplikat mellan varje proteinprov för att visualisera arrayen för mask montering. Efter utskrift, ta bort proteinet mikro array diabilder från den befuktade miljön.Därefter använder en ultraljud fogger för att generera en fin dimma av blockerande lösning som lägger sig på glidytan. Sedan blockera bilderna över natten med 5%mjölk i PBST för att inaktivera ytan. Förvaras glider på minus 20 grader Celsius i 50%glycerol för att förhindra frysning.Interaktioner mellan extracellulära proteiner kännetecknas ofta av deras låga affiniteter. För att möjliggöra detektering av dessa interaktioner, genom att öka den bindande avidity, utvecklade vi en multivalent strategi baserad på avskiljning av det efterfrågade proteinet uttryckt som FC taggade extracellulära domäner på protein A belagda mikropärlor. Snurra på bäraren IgG, som har märkts med Cy5 monoreaktiva färgämne som beskrivs i textprotokollet.För att beräkna molarförhållandet för frågeproteinet och Cy5 IgG, dividera molekylvikten för frågeproteinet med molekylvikten för IgG och multiplicera med 40 mikrogram per milliliter för att bestämma koncentrationen av Cy5 IgG som behövs. När alla nyckeltal har fastställts bildar mikro pärla protein komplex genom att kombinera FC taggade frågan och Cy5 IgG med proteinet A micro pärlor. Blanda upphängningen i PBS på en rörrotator i 30 minuter i rumstemperatur, skyddad från ljus.För att påbörja screeningen, värm de förberedda bilderna i rumstemperatur innan du laddar på hybridiseringsstationen. För att utföra screeningen, tvätta först mikromatrisen med PBST i en minut för att avlägsna kvarvarande glycerol. Ladda 200 mikroliter av ett milligram per milliliter protein A i PBS 5%mjölk och inkubera i 30 minuter för att förhindra okommet protein A mikropärlor från att binda till FC taggade proteiner som kan finnas i mikro array.Efter hybridisering stationen tvättar objektglasen med PBST, ladda 200 mikroliter av frågan mikropärla komplex, i närvaro av ett milligram per milliliter protein A och inkubera i 30 minuter. Efter hybridisering och tvättning av rutschkanorna av hybridiseringsstationen, skölj diabilder med vatten och placera dem i enskilda 50 milliliter koniska rör. Torka rören genom att snurra på 900 gånger G i fem minuter.Slutligen, skanna bilderna med en mikro array scanner lämpligt att upptäcka Cy3 och Cy5 fluorescens genom spännande på 532 och 635 nanometer, respektive. Visas här är en representativ bild av en tryckt bild. Cy3 märkta bovint serum albumin fläckar är i grönt.Fläckarna trycktes i två exemplar som en kvalitetskontroll av tryckprocessen. Representativa resultat av ett föräldralöst protein, screenas för identifiering av bindande partner med hjälp av extracellulära protein mikro array teknik, visas här. De dubbla röda fläckarna identifieras som en träff för det avskärmade frågeproteinet.Denna metod som beskrivs är mycket mångsidig och kan användas för tryckning av ett spektrat av proteinbibliotek, vara de specifika proteinfamiljer eller stora sammanställningar av proteiner som vår. Alla protein av intresse kan utvärderas. Samtidigt som man försöker detta förfarande är det viktigt att hantera diabilderna med omsorg och att se till att de inte torkar ut så att förhindra förlust av aktivitet av de proteiner som skrivs ut.Efter skärmen av ett protein av intresse, är det mycket klokt att ytterligare validera eventuella träffar observeras med hjälp av ortogonala tekniker, såsom yta plasmon resonans. Efter dess utveckling har denna teknik banat väg för forskare att studera extracellulära protein interaktioner hos människor.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust och hög genomströmning enda molekyl Flow Stretching Assay genomförandet för att studera Transport av molekyler längs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Användning av mikroskala termofores för att mäta protein-lipidinteraktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

NMR-experiment med högt tryck för detektering av protein låglänta konformations tillstånd

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

En "dual-addition" kalciumfluorescensanalys för screening med hög genomströmning av rekombinanta G-proteinkopplade receptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimering av flödescytometriska sorteringsparametrar för isolering med hög genomströmning och rening av små extracellulära vesiklar

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Proteinkristallisation med hög kapacitet via mikrodialys

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...