Name: real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system
Uploaded: 2018-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

De auteurs wil erkennen van Dr. Wade Sigurdson voor het verstrekken van waardevolle inbreng in het ontwerp van het apparaat van de stroom.

1. Monteer het apparaat van de stroom
<ol><li>Configureer de onderdelen weergegeven in de Tabel van de materialen volgens het schema in Figuur 1 met de overwegingen hieronder besproken. Opmerking: Voor het gemak, de stroom apparaat is verdeeld in twee kanten, de groene kant (alles stroomopwaarts van de dia aan de media kolven) en de oranje kant (alles stroomafwaarts van de dia aan de media kolven).<ol>
<li>Zorg ervoor dat alle van het apparaat van stroom luchtdicht te v...

<ol>
	<li>Pankhurst, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidiasis+(oropharyngeal).">Candidiasis (oropharyngeal).</a> BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Revista iberoamericana de micolog&#237;a. 18 (4), 163-170 (2001).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p.">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li><li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+biofilm:+a+fungal+perspective.">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).</li><li>Ara&#250;jo, D., Henriques, M., Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+Candida+Species+Biofilm+Regulatory+Network+Genes.">Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes.</a> Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).</li><li>Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+planar+flow+cell+for+studies+of+biofilm+heterogeneity+and+flow-biofilm+interactions.">A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions.</a> Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).</li><li>Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+economical+in+vitro+method+for+the+formation+of+Candida+albicans+biofilms+under+continuous+conditions+of+flow.">An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow.</a> Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>McCall, A., Edgerton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Approach+to+Flow+Cell+Imaging+of+Candida+albicans+Biofilm+Development.">Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development.</a> Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).</li><li>Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussian+approximations+of+fluorescence+microscope+point-spread+function+models.">Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models.</a> Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+Binding+to+Candida+albicans+Hyphae+Enables+Its+Development+in+Oropharyngeal+Candidiasis.">Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis.</a> PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).</li></ol>

Met behulp van de stroomsysteem zorgt zoals hierboven beschreven voor de generatie van kwantitatieve time-lapse video's van schimmel biofilm groei en ontwikkeling. Als u wilt toestaan voor vergelijkingen tussen experimenten is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat de imaging parameters hetzelfde blijven. Het is hierbij om ervoor te zorgen dat de Microscoop is ingesteld voor Köhler verlichting voor elk experiment (vele gidsen zijn online beschikbaar voor dit proces). Naast de imaging parameters, zijn er enkele bel...

Candida albicans (C. albicans) is een opportunistische schimmel pathogeen voor mensen die veel weefselsoorten, met inbegrip van mondelinge mucosal oppervlakken, orofaryngeale candidiasis veroorzaakt en wat resulteert in een lagere kwaliteit van leven voor beïnvloede individuen1kan infecteren. Biofilm vorming is een belangrijk kenmerk voor de pathogenese van C. albicans, en talrijke studies zijn gedaan over de vorming en de functie van C. albicans biofilms2,3,4, 5, waarvan vele zijn uitgevoerd met behulp van statische (geen stroom) in vitro modellen. C. albicans moet echter houden en groeien in aanwezigheid van speeksel stroming in de mondholte. Talrijke stroom systemen zijn ontwikkeld om te voorzien in live-cel imaging6,7,8,9,10. Deze verschillende stroom-systemen zijn ontworpen voor verschillende doeleinden, en daarom elk systeem heeft verschillende sterke en zwakke punten. Vonden wij dat veel van de stroom systemen geschikt zijn voor C. albicans waren duur, vereiste complex vervaardigde onderdelen, of kon niet worden beeld tijdens stroom en moest worden gestopt voordat de beeldvorming. Daarom ontwikkelden we een nieuwe stroom apparaat om te studeren C. albicans biofilm vorming onder stroom11. Tijdens het ontwerp van onze apparaten van de stroom, wij gevolgd deze belangrijke overwegingen. Ten eerste, we wilden kunnen kwantificeren van meerdere aspecten van de biofilm groei en ontwikkeling in real-time zonder het gebruik van fluorescerende cellen (toelatend ons aan studie gemuteerde stammen en ongewijzigde klinische isolaten gemakkelijk). Ten tweede wilden we alle onderdelen om commercieel beschikbaar met weinig tot geen wijzigingen (dwz., geen aangepaste fabricage), zodat anderen meer gemakkelijk opnieuw ons systeem en waardoor voor eenvoudige reparaties. Ten derde, we wilden ook toestaan voor uitgebreide imaging keer op redelijk hoog debiet. Tot slot, we wilden, na een periode van cellen verbonden zijn aan het substraat onder stroom, kunnen controleren de biofilm groei gedurende een langere tijd zonder de invoering van nieuwe cellen.
Deze overwegingen leidde ons naar het ontwikkelen van het twee-kolf recirculatie-stroomsysteem geïllustreerd in Figuur 1. De beide kolven kunnen we het experiment in twee fasen, de fase van een bijlage die uit de cel-geplaatste bijlage kolf trekt en een groeifase waarbij de cel-vrije media om te blijven de biofilm groei zonder de toevoeging van nieuwe cellen splitsen. Dit systeem is ontworpen om te werken met een incubatie kamer voor de Microscoop, waarbij de dia en de slang voorafgaand aan het (2 tot en met 5, Figuur 1) wordt geplaatst in de incubator, en alle andere onderdelen geplaatst in een grote secundaire container buiten de Microscoop. Een kookplaat roerder met een bijgevoegde temperatuursonde wordt bovendien gebruikt om schimmel cellen in de kolf van de bijlage bij 37 ° C. Zoals het opnieuw circuleren is, dit systeem is geschikt voor continue imaging tijdens stroom (kan worden meer dan 36 h afhankelijk van omstandigheden), en kan worden gebruikt op de meeste standaard microscopen, met inbegrip van rechte of omgekeerde benchtop microscopen. Hier bespreken we de vergadering, operatie, en schoonmaken van het apparaat van stroom, ook als bieden sommige fundamentele ImageJ kwantitatieve algoritmen voor het analyseren van de video's na een experiment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">07522-20</td>
			<td style="width:229px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pump head</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">77200-60</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">96410-14</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap adapter</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">30704-84</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bubble trap vacuum adapter for 1/4&#8221; ID vacuum line</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31500-55</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">In-line filter adapter (4 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-40</td>
			<td>8,9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orange-side Y</td>
			<td style="width:71px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">31209-55</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Green-side Y</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10827</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slides</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* Slide luers</td>
			<td style="width:71px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">10802</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Vacuum assisted Bubble trap</td>
			<td style="width:71px;">Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Media flasks</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4980-500</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2 &#181;m air filter</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431229</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">1395-100</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129750</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Screwcap tubing connector</td>
			<td style="width:71px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">1129814</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tubing connector beveled washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88579</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing connector flat washer</td>
			<td style="width:71px;">Danco</td>
			<td style="width:119px;">88569</td>
			<td>5,10</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed)</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">15100002-100</td>
			<td>7,8,9</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Clamp tool</td>
			<td style="width:71px;">Oetiker/MSC Industrial Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">14100386</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">20 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1331</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">10 micron in-line media filter</td>
			<td style="width:71px;">Analytical Scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">850-1333</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2 micron inlet media filter</td>
			<td style="width:71px;">Supelco/Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">58267</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SVGV010RS</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">* 0.22 &#181;m media filter &#8220;adapter&#8221;</td>
			<td style="width:71px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">329654</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rubber stopper</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-131E</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hotplate stirrer with external probe port</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880006</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88880147</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging and quantification of fungal biofilm development using a two-phase recirculating flow system

In orofaryngeale candidiasis, moeten leden van het geslacht Candida zich houden aan en groeien op de mondelinge mucosal oppervlakte terwijl onder de gevolgen van speeksel stroom. Terwijl de modellen voor de groei onder stroom hebben ontwikkeld, veel van deze systemen zijn duur, of niet toestaan imaging terwijl de cellen onder stroom. We hebben een nieuw apparaat dat ons toelaat om de groei en de ontwikkeling van Candida albicans cellen onder stroom en in real-time beeld ontwikkeld. Hier, detail we het protocol voor de vergadering en het gebruik van dit apparaat van de stroom, evenals het kwantificeren van gegevens die worden gegenereerd. We kunnen de tarieven die de cellen koppelen aan en loskoppelen van de dia, evenals over het bepalen van een maatregel van de biomassa op de dia na verloop van tijd kwantificeren. Dit systeem is zowel economische als veelzijdig, werken met vele soorten licht microscopen, met inbegrip van goedkope benchtop microscopen, en staat uitgebreid imaging keer in vergelijking met andere systemen van stroom. Globaal, dit is een laag-doorvoer systeem dat zeer gedetailleerde real-time informatie over de groei van de biofilm van schimmel soorten onder stroom verschaffen kan.

Representatieve beelden van een normale nachtelijke time-lapse experiment met wild-type C. albicans cellen bij 37 ° C te zien in Figuur 2 en aanvullende Video 1. De beelden zijn contrast enhanced ter verbetering van de zichtbaarheid. Kwantificering van de oorspronkelijke gegevens werd uitgevoerd, en representatieve grafieken te zien in Figuur 2B. Voor het genereren van ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System at JoVE.com

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

We beschrijven de vergadering, operatie, en schoonmaken van een apparaat van de stroom ontworpen om schimmel biofilm beeldvorming in real-time terwijl onder stroom. Wij bieden ook en bespreken van kwantitatieve algoritmen worden gebruikt op de verworven beelden.

Real-time Imaging en kwantificering van schimmel Biofilm ontwikkeling met behulp van een bewerking in twee fasen recirculatie-stroomsysteem

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de microbiologie veld, zoals hoe vloeistofstroom verandert schimmel biofilm groei en ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de effecten van flow op de groei en ontwikkeling van biofilm in real time kwantitatief te evalueren. Begin dit experiment met de montage van het stroomapparaat, zoals beschreven in het tekstprotocol.De dag van het experiment, bevestig de bubble trap, temperatuur sonde, en alle componenten voor eenmalig gebruik. Om het filter te monteren, verwijder de zuiger uit een spuit van één milliliter om er een adapter van te maken. Forceer de slang van de filterfles in dit uiteinde en bevestig een 2 micron filter aan de slang die leidt naar de groeifles.Breng siliconenvacuümvet aan rond de weerhaak van de schuifadapter voordat u deze aansluit, omdat dit helpt om luchtlekken in het systeem te voorkomen. Vul de bevestigingskolf met 100 milliliter YPD en vul de groeikolf met 200 milliliter YPD. Zorg ervoor dat de groene zijslang de media in elke kolf bereikt.Zorg ervoor dat alle kleppen open zijn. Bevestig de bellenval aan een vacuüm en sluit de pomp aan op de groene zijbuizen stroomafwaarts van de bellenval. Pomp de vloeistof met een stroomsnelheid van 3,3 milliliter per minuut om de groene kant volledig te vullen.Dan, afzien en gooi ongeveer een tot twee milliliter van de media, omdat de eerste paar milliliter bevatten vaak dode cellen of willekeurig puin. Zorg ervoor dat de groene kant van de slang is gevuld met media en heeft geen bubbels stroomafwaarts van de bubble trap voordat u verdergaat. Vul de kanaalschuif en het reservoir met YPD, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bellen worden geïntroduceerd.Sluit de glijbaan aan op het stroomapparaat. Pomp dan meer vloeistof om een buffer van ongeveer 5 meter aan de oranje kant te creëren. Dit om te voorkomen dat er per ongeluk lucht in de glijbaan wordt vastgestroomd in geval van terugstroom.Bereid nu het stroomapparaat voor op transport naar de microscoop door eerst de inlaat en uitlaat van de gesloten bellenval te planten. Klem vervolgens de groene en oranje zijzijdekolfkleppen gesloten. Zorg ervoor dat de schroefdoppen voor de pulsatiedemper en filterfles strak zitten, omdat ze tijdens autoplating los kunnen komen.Koppel de pomp los aan de slang om het transport gemakkelijker te maken. Verplaats vervolgens alle componenten, inclusief de hete plaat roerder, in een secundaire container in de buurt van de microscoop. Bevestig de temperatuursonde aan de hete plaat roerder, en beginnen met het verwarmen van de bevestigingskolf tot 37 graden Celsius.Roer de media op 300 RPM, en onderhoud dit voor het hele experiment. Monteer de glijbaan op de microscoop en gebruik indien nodig tape om deze stevig vast te zetten. Bevestig vervolgens de bellenval aan een vacuüm.Sluit nu de pomp aan op het stroomapparaat. Start de pomp met een stroomsnelheid van 3,3 milliliter per minuut, en laat het draaien voor ongeveer vijf tot 10 seconden. Verwijder vervolgens de bubble trap in let-out deksel clan.Laat de pomp blijven draaien terwijl de bevestigingskolf opwarmt. Zodra de bevestigingskolf en incubatiekamer beide op 37 graden Celsius zijn, voeg voldoende nachtelijke cultuur van de schimmelcellen toe aan de bevestigingsfles om een miljoen cellen per milliliter te bereiken. Wacht 15 minuten om de cellen te laten acclimatiseren.Open zowel groene als oranje zijbevestigingskolfkleppen terwijl het sluiten van beide groeikolfkleppen om de stroom van cellen te starten. Wacht ongeveer vijf minuten om cellen de dia te laten bereiken. Gedurende deze tijd, focus de microscoop en aan te passen aan dezelfde beeldvorming parameters gebruikt in eerdere experimenten.Begin met het verwerven van afbeeldingen voor de bevestigingsfase. Kom na ongeveer vijf en 10 minuten terug om ervoor te zorgen dat de focus behouden blijft. Zo niet, probeer dan de focus direct na de volgende afbeelding aan te passen.Sla onmiddellijk nadat de bijlagefase is voltooid, het bestand op. Open vervolgens zowel groene als oranje zijgroeikolfkleppen terwijl beide bevestigingskolfkleppen worden gesloten. Zorg ervoor dat u het podium niet stoot als er kleppen in de incubatiekamer zitten.Haal de thermometersonde los en vervang de bevestigingskolf door de groeikolf. Configureer nu de software om elke 15 minuten gedurende 22 uur een afbeelding te verkrijgen en begin met het verwerven van afbeeldingen voor de groeifase. Zodra de groeifase overname is voltooid en het bestand is opgeslagen, open de groene en oranje kant bevestigingskolf kleppen, die een geluid kan maken als de druk releases aan de oranje kant.Trek op de groene zijbuizen die uit beide mediakolven komen, tot zij minstens verscheidene centimeters boven de media zijn. Dan, voer de pomp op een hoge snelheid om alle media te verwijderen uit de slang, waardoor het schoonmaken veel gemakkelijker. Tot slot, kwantificeren van de video's zoals beschreven in het tekstprotocol.Deze time lapse dark field microscopie video toont de bevestiging van wilde type Candida albican cellen aan het substraat onderstroom tijdens de bevestigingsfase, gevolgd door de daaropvolgende groei en ontwikkeling tijdens de groeifase die leidt tot biofilmvorming. De gegevens van deze video's kunnen worden geanalyseerd voor de tarieven van celbevestiging en onthechting en biomassa in de tijd, hier getoond is de totale biomassa binnen de beeldvorming regio zoals bepaald door densitometrie analyse. De cumulatieve snelheid van celbevestiging en het percentage biomassa onthechting na verloop van tijd worden ook weergegeven.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om dezelfde beeldvorming voorwaarden te gebruiken voor alle experimenten, omdat dit het mogelijk maakt voor kwantitatieve vergelijkingen worden gemaakt tussen hen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

Real-time beeldvorming van leukotriënen B 4 Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa en Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow cellen

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...