Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
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密歇根州立大学化学系提供了资金和支助。

1. 浇注原生绿凝胶的库存解决方案准备
<ol><li>准备一个4倍浓缩缓冲液来解决凝胶, 其中包括40% 甘油、200 mm 甘氨酸和 100 mm 特莱姆缓冲至 ph 8.3。</li>
	<li>为堆叠凝胶准备4倍浓缩缓冲液, 其中包括40% 甘油、200 mm 甘氨酸和 100 mm 土耳其缓冲至 ph 6.3。</li>
	<li>将这些缓冲液存放在 4°c, 以防止霉菌生长。 注意: 在4°c 下, 缓冲区稳定数月, 因此建议准备每个缓冲区的 100-200 ml, 以便继续使用。</li>
	<li>准?...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

成功的类囊样增溶和本地凝胶运行将导致在凝胶上的多个明显可见的绿色带的分辨率, 而不会明显变形或涂抹的带。超载凝胶, 高洗涤剂浓度, 不正确的样品 ph 值, 未溶解的材料, 运行凝胶过快或在过高的温度, 和不适当的浇注凝胶, 都可能导致不良的类囊样配合物。在优化凝胶本身的条件 (例如, 丙烯酰胺梯度浓度) 的同时, 它可以帮助最大限度地解决感兴趣的波段。我们的经验是, 增溶条件和...

光合生物必须不断调整其生理特性, 以适应不断变化的环境条件, 最大限度地提高其生产力, 并成功地与邻居竞争1。负责光合作用光反应的机械尤其如此, 因为环境光条件在阴影和充分阳光之间可能会波动三个数量级。此外, 干旱、寒冷或热应激等环境因素会减少用于固碳的二氧化碳的供应, 而碳固定是光反应产物的天然电子汇。因此, 植物必须尽可能高效地收获和利用太阳辐射, 同时保持必要时耗散多余光能的能力。虽然光氧化损伤仍然经常发生在所有光线条件下2,3, 未能成功地管理吸收激发能量可能导致灾难性的细胞损伤和死亡。存在几种适应机制, 使光合装置既能适应当前环境条件的变化, 又能适应瞬态波动 (即长时间和短时间内的波动)4。其中包括长期反应 (ltr) 和非光化学淬火 (npq)。npq 本身被认为包含至少三个其他成分现象, 包括状态跃迁 (qt)、快速诱导能量淬火 (qT) 和光抑制 (qi)5。
这些过程最初是在光谱现象的角度观察和定义的 [例如, npq 指的是观察到的叶绿素荧光 (叶绿素荧光淬火) 的下降, 这不是由于增长率的增加。光化学]6。术语 "状态转换" 同样指的是从 psi 和 psii7观察到的荧光相对量的变化。虽然光谱技术使这些现象的枚举成为可能 [特别是脉冲调幅 (pam) 荧光光谱], 并继续是观察和剖析光合过程的重要手段在体内, 需要大量的生物化学来阐明这些光谱观测的机制。例如, 状态转变涉及由 stn7 激酶和 TAP38/PPH1 磷酸酶 (分别为 8、9、10) 对 lhcii 蛋白进行磷酸化/磷酸化循环。这个周期通过将 lhcii 三元组的一部分从 psii 移动到 psi, 从而改变光系统 11, 12 的吸收截面, 调整两个光系统之间的物理分布.npq 的 qe 组分通过紫菜的作用, 通过紫菜素/西沙/环氧循环和 psbs 蛋白的作用, 迅速将多余的激发能量转化为热量。psbs 在这一过程中的确切作用仍未完全了解 13。npq 的 qi 成分, 光抑制, 一般归因于对 psii 的 d1 蛋白的损害。恢复完全的光合能力需要一个复杂的修复过程来修复损坏的 psii 光合仪。psii 修复周期包括 psii 复合物从粮库中迁移、拆除复合物、更换受损的 d1 蛋白、重新组装 psii 复合物以及将 psii 复合物运回宏伟的堆栈 14.光抑制和 psii 光污染的确切性质仍然是一个严格审查的主题.
研究状态转换或 psii 修复等现象的困难, 部分原因是没有一种简单的方法来可视化复杂生化系统的力学。理解一个过程的经典生化方法是首先分离其组成部分, 以便能够孤立地描述它们。本地凝胶电泳产生于20世纪80年代的成功努力, 用更多的制备方法 (即蔗糖梯度离心和色谱法)分离和表征类囊体膜中的光系统复合物。为从类囊体膜中轻轻溶解原生复合物而开发的洗涤剂系统很快就适应了电泳分离方法, 最引人注目的是艾伦和施特赫林17号以及彼得和索伯18, 从而产生了原生绿色凝胶电泳。虽然在实验库中只代表了各种技术中的一种, 但原生 page 具有许多吸引人的特性, 使其成为光合作用研究中广泛使用的方法。原生 page 速度相对较快、简单, 只需很少的专用设备, 同时还能同时对大量类囊体进行高分辨率分离。这使得原生 page 成为研究类样体动力学的便捷工具, 并且, 当与第二维的标准 page 以及各种洗涤剂和缓冲系统结合使用时, 这是一个用于查找和表征新的类囊样复合物的多功能系统。
话虽如此, 土生土长的绿胶已经有了一个不可靠的技术的声誉, 特别是在经验不足的手中, 因为它很容易产生糟糕的结果, 包括模糊, 涂抹凝胶与很少的波段。这个问题在一定程度上被解决了与蓝色原生页19的介绍。在 bn 缓冲系统中使用共体染料, 使蛋白质分离更加稳健。因此, bn-page 通常是相对新手建立的一种更容易、更可靠的技术, 可以提供高分辨率的类囊样复合物分离。由于这些原因, bn-page 已成为这一领域大多数工作的首选方法。虽然 bn-page 的运行速度通常比绿色凝胶电泳慢, 但其主要缺点是, 同轴染料染色干扰了对含有叶绿素的微弱带的识别, 同时也使下游光谱表征有问题。
将原生凝胶和 2d sds-page 提供的生化信息与光谱技术的数据相结合, 可以得到极大的加强。无论使用哪种系统, 使用原生凝胶来识别复合物的一个核心问题是, 识别总是可以受到挑战 (即,在带中发现的蛋白质总是可以代表组合物或成分, 而不是比单一的生理正宗的复合)。光谱特性提供了有关绿色凝胶带中的颜料的生物物理信息, 并可用于确定它们可能含有哪些类型的复合物。叶绿素荧光在这方面特别有用, 因为不同光合色素蛋白复合物的光谱和荧光寿命往往有很大的不同。虽然简单的稳态77k 荧光光谱历来可用于确认原生凝胶复合物的身份, 但现代时间相关单光子计数 (tcspc) 可以提供更多的信息。tcspc 不仅可以根据荧光寿命对配合物进行表征, 还可以详细描述复合物中光谱成分之间的能量传递。随着各种原生凝胶体系的使用和新的假定复合物的发现, 这种特性变得越来越有必要, 从而能够更好地鉴定蛋白质复合物, 并提供新的关于这些综合体如何工作的生物物理信息。
在本文中, 我们提供了一种方法, 使那些很少或没有本地凝胶电泳经验的人, 以实现高质量的分辨率的原生类囊状配合物, 目的是研究光反应的力学光合作用。然后, 实验者可以酌情补充这一基本技术, 以提高结果或将适用性扩大到其他物种。然后, 我们描述了将原生绿色凝胶带置于 tcspc 之下的过程, 以及对该技术提供的数据进行基本分析和表示的一些步骤。本机凝胶电泳与 tcspc 分析的耦合, 通过提供对波段内蛋白质复合物的认证和生物物理表征, 扩展了这些凝胶系统的效用。这里描述的绿色凝胶系统是基于艾伦和施特赫林17开发的, 经过一些修改, 与施瓦茨等人使用的系统相同。20. 这一制度是许多系统之一, 但具有对这一方法有用的具体特点。它的速度足够快, 可以在一天内进行类样体分离、凝胶电泳和 tcspc 分析方便, 避免了样品储存和降解的潜在问题。我们还发现, 这种方法在经验不足的用户手中是稳健的, 同时仍然提供从好到优越的结果, 这取决于优化的程度。
重要的是要记住, 在原生凝胶上可视化的复合物取决于所使用的洗涤剂和缓冲液系统, 以及被调查的生物体的生物学。不同的洗涤剂和缓冲系统优先分离不同种类的配合物, 特定的光合生物将有不同的复合物从其他有机体, 并且不是所有在任何特定情况下都会存在。这里描述的系统特别适合于研究 psi 巨细胞, 如 schwarz等人所述。20, 但对于那些研究 psii 巨型巨细胞的人来说, 它落在了更不稳定的光谱端。为了全面研究用于囊样蛋白原生凝胶电泳的各种洗涤剂和缓冲液系统, 建议对 järvi等人进行综述。21和 rantala等人22岁

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

光合作用的光反应是由囊状细胞膜中的一系列色素蛋白复合物进行的。由于光合作用适应不断变化的环境条件 (即非光化学淬火、状态转换和长期反应)。从历史上看, 这些过程被用光谱的角度描述为叶绿素荧光的变化, 光谱仍然是监测光合参数的重要方法。可以可视化潜在蛋白质复杂动力学的方法有限。在这里, 我们描述了一种快速和简单的方法, 高分辨率分离和可视化类样体复合物, 本地绿色凝胶电泳。该方法与时间相关的单光子计数相结合, 详细描述了在绿色凝胶上分离的带的叶绿素荧光特性。

绿色凝胶电泳的代表性结果见图 1。车道1提供了一个理想的结果, 为菠菜类类的绿色凝胶电泳, 其中可见的是一个清晰, 尖锐的绿色带的最大数量。这些结果有些非典型, 部分原因是在第1车道上看到的波段通常都存在于给定的样本中。额外的样品清理, 在类囊体增溶之前以叶绿体分离的形式, 以及梯度凝胶电泳 (4-7 丙烯酰胺) 通常也是实现最佳结果所必?...

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

在这里, 我们提出了一个协议, 以分离溶解性类囊化复合物的本地绿色凝胶电泳。绿色凝胶带随后通过时间相关单光子计数 (tcspc) 进行了表征, 并提供了数据分析的基本步骤。

利用本地绿色凝胶电泳分离菠菜类黄体蛋白配合物, 用时间相关单光子计数表征

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

这种方法对于回答光合作用研究领域的某些关键问题很有用，例如，使用能量连接的成分在生理上是真复杂吗？绿色凝胶和 TCSPC 协议的主要优点是，它快速而坚固。样品可以在一天中轻松处理和分析，使存储和稳定性问题减少。虽然TCSPC可以提供我们在此研究的光合作用系统的见解，它也可以应用于其他系统，从化学到物理和生物，如研究荧光分子运动在液体，细胞，或新颖的结构图案，如单分子层和离子液体。要开始此过程，请准备文本协议中概述所需的库存溶液和绿色迷你凝胶。接下来，获取一些冰和调暗的灯光。使用玻璃 Dounce 均质器，将菠菜叶完全均匀化，在大约 1 到 2 毫升的 TMK 缓冲液中。要创建一个简单的过滤设备，请将精细的任务擦除成两半，然后折叠成多个季度。从注射器上取下柱塞，然后将折叠的任务擦拭到注射器的底部。将叶均质移入任务擦拭过滤器的中心，然后使用柱塞通过过滤器将均质液通过，并在 1.5 毫升离心管中收集。在5000克和4摄氏度下将同质质离心10分钟，使不溶性物质（包括胸腺膜）进行颗粒化。丢弃上流液，将颗粒重新在一毫升 TMK 缓冲液中。要从每个样品中提取叶绿素，请取一个50微升的等分，然后转移到1.5毫升的微离心管中。加入950微升甲醇，盖上管子，并多次倒置。在10，000克下离心10分钟，对沉淀的蛋白质进行沉淀。以叶绿素浓度测量为指导，必要时从每个样品中去除并丢弃一些体积，直到每个管中含有相同量的叶绿素。在5000克下离心10分钟，重新对胸腺膜进行组装。拆下并丢弃上一液，小心去除所有上一液，而不干扰颗粒。首先，解冻一个等分的TMK 30%甘油洗涤剂溶液。反转几次，混合和保持溶液在冰上。加入适当体积的洗涤剂溶液溶解颗粒，最终叶绿素浓度为每毫升一毫克。反复上下移液，同时小心避免在样品中起泡。然后，将样品放在冰上，让胸腺素样品溶解。溶解完成后，将样品在10，000克和4摄氏度下离心10分钟，对不溶性物质进行颗粒化，形成透明、深绿色的上清液。在此之后，将15微升的溶解胸腺素中分直接加载到先前准备的1.5毫米原生凝胶的每一个井上。使用 1X 运行缓冲液，以 100 伏电压开始运行原生绿色凝胶。在运行期间将整个凝胶罐放在湿冰上，以降低电阻加热。凝胶运行完成后，将其从电泳电池中取出，然后用蒸馏水冲洗凝胶板的运行缓冲液。从凝胶中取下顶板，然后用蒸馏水冲洗凝胶。将仍在底部玻璃板上的凝胶放在冰上;当凝胶不使用时，用塑料包装盖住，并在黑暗中保持干燥。接下来，在准备进行 TCSPC 分析时，使用锋利的手术刀或剃刀刀片切除每个感兴趣的波段。确保切除带不包含污染带材。对于每个被分析的复合物，使用荧光光谱仪使室温荧光光谱在 600 到 800 纳米之间。将遮蔽胶带放在幻灯片的两端，并折叠多次以创建垫片，从而允许将幻灯片牢固地固定在一起，而不会压缩之间的空间，然后将凝胶片夹在两个玻璃显微镜幻灯片之间。在玻璃滑梯边缘的凝胶片中加入少量水，以创建平滑的界面，减少信号散射。接下来，将凝胶夹夹在梁路径中，使光束通过板的开放边缘撞击凝胶片。对于每个复合体，在荧光发射谱中定期收集 10，000 个总数据点。要分析给定复杂度的数据，首先对所收集的所有波长的每个衰减曲线的峰值高度进行规范化，然后尾部将每个衰减曲线与文本协议中概述的复合物的稳定状态荧光谱相匹配。绿色凝胶电泳的代表性结果为菠菜胸腺体分析提供了一个理想结果示例，其中可以看到许多清晰、锋利的绿色带。车道 2 和 3 在非梯度 5%丙烯酰胺凝胶上呈现简单胸腺分离和电泳的更典型结果。车道4、5和6提供了一个不良结果的例子，由于胸腺素样品的溶解程度增加，而车道7演示了使用阿拉伯胸腺基酮代替菠菜时可以达到的结果。TCSPC 数据的数据曲线设置为同一时间寄存器后，可以规范化到相同的峰值高度，从而允许将曲线作为数据的第一次分析进行比较。然后，不同复合物的峰值规范化衰减曲线可以在给定波长下彼此叠加，从而可以可视化复合体之间的行为差异。尾部匹配衰减曲线允许构建衰减相关光谱。如这里所见，LHCII的衰减相关光谱因缺乏动态特征而引人注目，LHCII荧光光谱的形状与信号衰减随时间而变化相同。荧光光谱的衰变也延迟，需要100皮秒才能达到最大荧光。这表明，当荧光衰减时，能量不会在复合体内具有能量分明的颜料之间转移。然后为波段 5 复合物构造衰减相关光谱。与LHCII相比，5波段的荧光衰变速度要快得多，在30皮秒内达到最大强度，500皮秒后衰减到初始强度的20%以下。在尝试此过程时，必须记住，对 TCSPC 数据的解释将依赖于其他生化信息，例如，通过 2 DSDS-PAGE 和西文图或质谱法来识别所研究的复合物的成分。

Research

JoVE Journal

Environment

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科研

环境科学

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