Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Finansiering og støtte blev leveret af Institut for kemi ved Michigan State University.

1. stamopløsninger forberedelse til hælde indfødte grønne geler
<ol><li>Forberede en 4 x koncentreret bufferopløsning til at løse geler bestående af 40% glycerol, 200 mM glycin og 100 mM Tris buffer til pH 8.3.</li>
	<li>Forberede en 4 x koncentreret bufferopløsning til stabling geler bestående af 40% glycerol, 200 mM glycin og 100 mM Tris buffer til pH 6.3.</li>
	<li>Gemme disse buffere ved 4 ° C til at forhindre vækst af skimmel. Bemærk: Bufferne er stabil i måneder ved 4 ° C, så forberedelsen af 10...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

En vellykket tylakoid oploesning og indfødte gel køre vil resultere i løsningen af flere forskellige synlige grønne bands på gel uden betydelige fordrejninger eller udtværing af bandene. Overbelastning gel, en høj vaskemiddel koncentration, en forkert prøve pH, uopløst materiale, kører gel for hurtigt eller for høj temperatur, og en forkert hældte gel er alle faktorer, der kan bidrage til dårligt løst tylakoid komplekser. Samtidig med at optimere betingelserne for gel, sig selv (fx., acrylamid grad...

Fotosyntetiske organismer skal hele tiden tilpasse deres fysiologi skiftende miljøforhold kan maksimere deres produktivitet og med held konkurrere med naboer1. Dette er især tilfældet for maskinen ansvarlig for lys reaktioner af fotosyntesen, som omgivende lys betingelser kan svinge af tre størrelsesordener mellem skygger og fuld sollys. Derudover kan miljømæssige faktorer såsom tørke, kulde eller varmestress reducere tilgængeligheden af kuldioxid til kulstof fiksation, som er naturlige elektron vasken for produkter af lys reaktioner. Planter skal derfor høst og udnytte solens stråler så effektivt som muligt samtidig bevare evnen til at bortlede overskydende lys energi som nødvendigt. Mens photooxidative skader opstår stadig rutinemæssigt under alle lysforhold2,3, manglende evne til at administrere absorberes excitation energi med succes kan føre til katastrofale celleskader og død. Flere adaptive mekanismer eksisterer der tillader fotosyntetiske apparatet til at blive tunet både ændringer i fremherskende miljøforhold og forbigående udsving (dvs. over både lange og korte tidshorisonter)4. Disse omfatter langsigtede svar (LTR) og ikke-fotokemisk dæmper (NPQ). NPQ er i sig selv anses for at omfatte mindst tre andre komponent fænomener, herunder statens overgange (qT), hurtigt inducerbar energi quenching (qE) og photoinhibition (qI)5.
Disse processer var oprindeligt observeret og defineret i vid udstrækning i forhold til spektroskopiske fænomener [fx NPQ refererer til et fald i observerede klorofyl fluorescens (quenching af klorofyl fluorescens), ikke der skyldes en stigning i antallet af fotokemi]6. Udtrykket "statens overgange" ligeledes henviser til de observerede ændringer i den relative mængde af fluorescens fra PSI og PSII7. Mens de spektroskopiske teknikker, der har muliggjort opregning af disse fænomener [bl.a puls amplitude moduleret (PAM) Fluorescens spektroskopi] og fortsat være et vigtigt middel til at observere og dissekere fotosyntetiske processer i vivo, en hel del af biokemi er forpligtet til at belyse mekanismerne bag disse spektroskopiske observationer. Statens overgange, indebærer for eksempel en fosforylering/dephosphorylation cyklus af LHCII proteiner af STN7 kinase og TAP38/PPH1 fosfatase, henholdsvis8,9,10. Denne cyklus justerer den fysiske distribution af LHCII antenne mellem de to bannersystem ved at flytte en del af LHCII trimere fra PSII til PSI, dermed ændre absorptionen tværsnit af bannersystem11,12. QE komponent af NPQ omdanner hurtigt overskydende excitation energi til varme gennem handlinger violaxanthin/zeaxanthin epoxidation/de-epoxidation cyklus og PsbS protein. PsbS nøjagtige rolle i denne proces er endnu ikke fuldt forstået13. Komponenten qI, NPQ, photoinhibition, er generelt tilskrives for at beskadige til D1 protein af PSII. Restaurering af fuld fotosyntetiske kompetence kræver en omfattende reparation at fastsætte beskadigede PSII photocenters. PSII reparation cyklus indebærer overførsel af PSII komplekser ud af granal stakke, afvikling af komplekser, udskiftning af beskadigede D1 proteiner, gensamling af PSII komplekser, og flytningen af PSII komplekser tilbage til granal stakke14. Den nøjagtige karakter af photoinhibition og PSII solskader er fortsat genstand for intens15.
Vanskeligheden ved at studere fænomener som stat overgange eller PSII reparation skyldes delvis, at der er ikke en enkel måde at visualisere mekanikken i komplekse biokemiske systemer. Den klassiske biokemiske tilgang til at forstå en proces er at først separate dens komponenter, således at de kan karakteriseres i isolation. Native gelelektroforese opstod fra vellykkede indsats i 1980 ' erne til at adskille og karakterisere photosystem komplekser fra tylakoid membraner med flere forberedende metoder (nemlig saccharose gradient centrifugering og kromatografi)16. De detergent systemer udviklet til at forsigtigt solubilize de indfødte komplekser fra tylakoid membraner blev snart tilpasset til elektroforetisk adskillelse metoder, især af Allen og Staehelin17 og og Peter og Thornber18, giver anledning native grøn gel elektroforese. Mens der repræsenterer kun én ud af en række forskellige teknikker i den eksperimentelle arsenal, native side har en række attraktive egenskaber, der har gjort det enmetode bredt ansat i fotosyntesen forskning. Native side er forholdsvis hurtig og enkel, der kræver lidt specialiseret udstyr, mens det giver høj opløsning adskillelse af et stort antal tylakoid komplekser samtidigt. Dette gør indfødte side et praktisk værktøj til at studere tylakoid dynamics og, når kombineret med standard side i den anden dimension samt en bred vifte af vaskemiddel og buffer systemer, en alsidig system til at finde og karakterisere nye tylakoid komplekser.
Når det er sagt, har native grønne geler haft et ry for at være en upålidelig teknik, især i uerfaren hænder, da det er let at producere dårlige resultater bestående af fuzzy, smeary geler med få bands. Dette problem blev løst, delvis med indførelsen af blå-native side19. Brugen af coommassie farvestof i BN buffersystem gør protein adskillelse mere robust. Derfor, BN-side er ofte en nemmere og mere pålidelig teknik til en relativ novice til at konfigurere og kan levere høj opløsning separationer af tylakoid komplekser. Af disse grunde, er BN-side blevet den foretrukne metode for de fleste arbejde i dette felt. Mens BN-side er generelt langsommere at køre end grøn gelelektroforese, dens største ulempe er, at coommassie farvestof farvning forstyrrer identifikation af svage klorofyl-holdige bands, mens også gør downstream spektroskopiske karakterisering problematisk.
De biokemiske oplysninger leveret af indfødte geler og 2D SDS-PAGE kan styrkes kraftigt, når kombineret med data fra spektroskopiske teknikker. Et centralt problem med ved hjælp af indfødte gels til at identificere komplekser er uanset systemet ansat, at identifikationen kan altid blive udfordret (dvs. proteinerne, der findes i et band kunne altid repræsenterer comigrating komplekser eller komponenter, snarere end et enkelt fysiologisk autentiske kompleks). Spektroskopiske karakterisering trinvis pigmenter i grøn gel bands biofysiske og kan bruges til at afgøre, hvilke typer af komplekser de er tilbøjelige til at indeholde. Klorofyl Fluorescens er især nyttige i denne henseende på grund af den ofte dramatisk forskellige spektre og fluorescens levetid, der er karakteristiske for forskellige fotosyntetiske pigment-protein komplekser. Mens enkle steady-state 77K fluorescens-spektre har historisk set været nyttigt i bekræfter identiteten af indfødte gel komplekser, kan moderne tid-korreleret enkelt foton tælle (TCSPC) give meget mere information. TCSPC giver ikke kun en karakterisering af komplekser baseret på fluorescens levetid, men også gør muligt en detaljeret beskrivelse af energioverførsel mellem spektrale komponenter inden for et kompleks. Denne form for karakterisering stadig mere nødvendigt som brugen af forskellige indfødte gel systemer spreads og nye formodede komplekser er opdaget, identifikation af proteinkomplekser godkendes bedre og giver nye biofysiske oplysninger om, hvordan disse komplekser arbejde.
I dette papir, vi leverer en metode, der gør det muligt for dem, der har lidt eller ingen erfaring med indfødte gelelektroforese at opnå høj kvalitet opløsning af indfødte tylakoid komplekser med henblik på at undersøge mekanikken i lys reaktioner fotosyntese. Denne grundlæggende teknik kan derefter blive udvidet til den eksperimentatoren at forbedre resultaterne eller udvide anvendeligheden til andre arter. Vi beskriver derefter processen for underkaste indfødte grøn gel bands til TCSPC, samt nogle trin til grundlæggende analyse og præsentation af oplysningerne fra teknikken. Kobling af indfødte gelelektroforese med TCSPC analyse udvider nytten af disse gel-systemer ved at give godkendelse og Biofysisk karakterisering af proteinkomplekser bands fra. Grøn gel system beskrevet her er baseret på at udviklet af Allen og Staehelin17 med nogle ændringer og er den samme som bruges i Schwarz mfl. 20. dette system er en af mange, men har særlige funktioner, der er nyttige for denne metode. Det er hurtig nok så tylakoid isolation, gelelektroforese og TCSPC analyse praktisk kan udføres på én dag, hos potentielle problemer med opbevaring af prøven og nedbrydning. Vi finder også, at denne metode er robust i hænderne på uerfarne brugere, mens det stadig giver resultater der spænder fra gode til overlegen, afhængigt af graden af optimering.
Det er vigtigt at huske på, komplekser visualiseret på en indfødt gel afhænger på både vaskemiddel og buffer systemer anvendes og biologi af organisme under undersøgelsen. Forskellige vaskemiddel og buffer systemer adskille fortrinsvis forskellige slags komplekser, og en given fotosyntetiske organismer vil have forskellige komplekser fra andre organismer, ikke alle vil være til stede under de givne omstændigheder. Systemet beskrevet her er særlig velegnet til undersøgelse af PSI megacomplexes, som beskrevet i Schwarz mfl. 20, men det falder på den mere destabiliserende ende af spektret for dem studerer PSII megacomplexes. For en omfattende undersøgelse af de forskellige vaskemiddel og buffer systemer anvendes i native gelelektroforese af proteiner, tylakoid, anbefales det at gennemgå Järvi mfl. 21 og Rantala et al. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

Lys reaktioner af fotosyntesen er udført af en serie af pigmenterede proteinkomplekser i tylakoid membraner. Støkiometrisk og organisation af disse komplekser er yderst dynamisk på både lang og kort tidsskalaer på grund af processer, der tilpasser fotosyntese skiftende miljøforhold (dvs. ikke-fotokemisk quenching, statens overgange, og de langsigtede svar). Historisk set har disse processer har været beskrevet hjælp i form af ændringer i klorofyl fluorescens, og spektroskopi er fortsat en vigtig metode for fotosyntetiske overvågningsparametre. Der er et begrænset antal måder den underliggende protein komplekse dynamik kan visualiseres. Her beskriver vi en hurtig og enkel metode til høj opløsning adskillelse og visualisering af tylakoid komplekser, native grøn gelelektroforese. Denne metode er kombineret med tid-korreleret enkelt foton optælling for detaljerede karakterisering af klorofyl fluorescens egenskaber af bands adskilt på den grønne gel.

Repræsentative resultater for grøn gelelektroforese er præsenteret i figur 1. Lane 1 giver et eksempel på ideelle resultater for grøn gelelektroforese af spinat tylakoiderne, hvor et maksimalt antal klare, skarpe grønne bands er synlige. Disse resultater er lidt atypisk, delvis fordi ikke alle bands set i lane 1 er normalt findes i en given prøve. Ekstra prøve oprydning, i form af grønkorn isolation før tylakoid oploesning og gradient gelelektrofore...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Her præsenterer vi en protokol for at adskille solubilized tylakoid komplekser af indfødte grøn Gel elektroforese. Grøn gel bands karakteriseres efterfølgende af tid korreleret enkelt foton tælle (TCSPC) og grundlæggende trin til dataanalyse leveres.

Adskillelse af spinat tylakoid proteinkomplekser af indfødte grøn gelelektroforese og Band karakterisering ved hjælp af Time-Correlated enkelt foton tælle

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Denne metode er nyttig til at besvare visse centrale spørgsmål inden for fotosyntese forskning såsom er formodede thylakoid komplekser fysiologisk reelle komplekser med energisk forbundne komponenter? Den største fordel ved den grønne gel og TCSPC protokol beskrevet her er, at det er hurtig og robust. Prøver kan nemt behandles og analyseres på en enkelt dag, hvilket gør spørgsmål om opbevaring og stabilitet mindre af en bekymring.Selvom TCSPC kan give indsigt i de fotosyntetiske systemer, som vi har studeret her, kan det også anvendes på andre systemer lige fra kemiske gennem fysiske og biologiske såsom undersøgelser af fluorescerende molekylær bevægelse i væsker, celler eller nye-strukturelle motiver såsom monomolekylære lag og ioniske væsker. For at starte denne procedure skal du forberede de nødvendige lagerløsninger og grønne minigeler som beskrevet i tekstprotokollen. Dernæst få nogle is og dæmpe lysene.Ved hjælp af et glas Dounce homogenisator, fuldstændig homogenisere spinat blade i ca en til to milliliter TMK buffer. Hvis du vil oprette en simpel filtreringsenhed, skal du skære en delikat opgave tørre i halve og folde den i kvarte. Fjern stemplet fra en sprøjte, og pak derefter den foldede opgave tørre i bunden af sprøjten.Pipette bladet homogeniseres i midten af opgavesletningsfilteret, og brug derefter stemplet til at passere homogenatet gennem filteret og opsaml det i et 1,5 milliliter centrifugerør. Centrifuge homogenatet ved 5, 000 g og fire grader Celsius i 10 minutter for at pelletere det uopløselige materiale, herunder thylakoidmembranerne. Kassér supernatanten og opsplit pellet i en milliliter TMK buffer.For at udtrække klorofyl fra hver prøve, tage en 50-mikroliter aliquot og overføre det til en 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør. Tilsæt 950 mikroliter af methanol, cap røret, og bland ved at vende det flere gange. Centrifuge ved 10,000 g i 10 minutter for at pellete de udfældede proteiner.Ved hjælp af chlorophyllkoncentrationens målinger som rettesnor fjernes og kasseres nogle mængder fra hver prøve efter behov, indtil hvert rør indeholder den samme samlede mængde klorofyl. Centrifuge ved 5, 000 g i 10 minutter for at re-pellet thylakoid membraner. Fjern og kassér supernatanten, og vær omhyggelig med at fjerne al supernatanten uden at forstyrre pellet.Først optø en aliquot AF TMK 30% glycerol vaskemiddel opløsning. Inverter flere gange for at blande og holde opløsningen på is. Der tilsættes et passende volumen af vaskemiddelopløsningen for at opløse pelletsen, og der opstår en endelig klorofylkoncentration på 1 mg/ml.Pipette op og ned gentagne gange, samtidig med at du skal være omhyggelig med at undgå skumning i prøven. Derefter holde prøven på is, så thylakoid prøver til at opløse. Efter opløseligheden er afsluttet, centrifuge prøven ved 10, 000 g og fire grader Celsius i 10 minutter til pellet det uopløselige materiale, hvilket resulterer i en klar, mørkegrøn supernatant.Efter dette, belastning 15 mikroliter af opløselige thylakoid supernatant direkte på hver brønd af en tidligere forberedt 1,5-millimeter indfødte gel. Brug 1X kører buffer, begynde at køre den indfødte grønne gel ved 100 volt. Placer hele geltanken på våd is under hele løbet for at afbøde resistiv opvarmning.Når gelen er færdig med at køre, fjernes den fra elektroforesecellen, og den løbebufferen skylles af gelpladerne med destilleret vand. Fjern den øverste plade fra gelen og skyl derefter gelen med destilleret vand. Placer gelen, som stadig er på den nederste glasplade, på is;når gelen ikke er i brug, dække det med plastfolie og holde det i mørke for at forhindre det i at tørre ud.Brug derefter en skarp skalpel eller barberblad til punktafgifter hvert interessebånd, når du er klar til at gå videre med TCSPC-analysen. Sørg for, at det punkterede bånd ikke indeholder forurenende båndmateriale. For hvert kompleks, der analyseres, skal du bruge et fluorescerende spektrometer til at lave et rumtemperaturstofrøringsspektrum mellem 600 og 800 nanometer.Placer afdækningstape på hver ende af dias og fold det over flere gange for at skabe afstandsfraen, som vil gøre det muligt for dias, der skal holdes sammen fast uden at komprimere rummet mellem, så sandwich gelen skive mellem to glas mikroskopi dias. Tilføj en lille mængde vand til gelen skive på kanten af glasset dias for at skabe en glat grænseflade, der vil reducere signal spredning. Derefter klemme gel sandwich i strålen stien, så strålen rammer gelen skive gennem den åbne kant af pladerne.For hvert kompleks indsamles der 10.000 samlede datapunkter med jævne mellemrum på tværs af fluorescensemissionsspektret. For at analysere dataene for et givet kompleks skal du først normalisere tophøjden for hver henfaldskurve for alle de indsamlede bølgelængder, og derefter halematche hver henfaldskurve til kompleksets stabile tilstandsfluorescensspekt som beskrevet i tekstprotokollen. Repræsentative resultater for den grønne gel elektroforese giver et eksempel på et ideelt resultat for analysen af spinat thylakoider, hvor en række klare, skarpe grønne bånd er synlige.Vognbane 2 og 3 præsentere mere typiske resultater fra simpel thylakoid isolation og elektroforese på en ikke-gradient 5% acrylamid gel. Vognbane 4, 5 og 6 giver et eksempel på dårlige resultater på grund af stigende grader af underopalisering af thylakoidprøven, mens vognbane 7 viser de resultater, der kan opnås, når Arabidopsis thylakoider anvendes i stedet for spinat. Når datakurverne for TCSPC-dataene er blevet sat til samme tidsregister, kan de normaliseres til samme tophøjde, hvilket gør det muligt at sammenligne kurverne som en første analyse af dataene.Peak-normaliserede henfald kurver fra forskellige komplekser kan derefter overlejres med hinanden på en given bølgelængde, så forskellene i adfærd mellem de komplekser, der skal visualiseres. Hale matcher henfald kurver giver mulighed for opførelse af henfald-associerede spektre. Som det ses her, den henfald-associerede spektre for LHCII er bemærkelsesværdig for manglen på dynamiske funktioner og formen af LHCII fluorescens spektrum forbliver den samme som signalet henfalder over tid.Fluorescensspektrets henfald er også forsinket, hvilket kræver 100 picoseconds for at opnå maksimal fluorescens. Dette tyder på, at energi ikke overføres mellem energisk forskellige pigmenter i komplekset som fluorescens henfalder. Den henfalds-associerede spektre er derefter konstrueret til Band 5 kompleks.Sammenlignet med LHCII henfalder fluorescensen fra Bånd 5 meget hurtigere og når kun maksimal intensitet i 30 picosekonder og derefter henfalder til mindre end 20 % af den oprindelige intensitet efter 500 picosesekunder. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at fortolkningen af TCSPC data vil stole på yderligere biokemiske oplysninger, der identificerer komponenterne i de komplekser, der undersøges, for eksempel ved 2 DSDS-PAGE og vestlige Blotting eller massespektrometri.

Research

JoVE Journal

Environment

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimeret negativ farvning: en High-throughput protokol for behandlingen Små og asymmetrisk proteiners struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automatiseret Gel Size Selection For at forbedre kvaliteten af ​​Next-generation sequencing biblioteker fremstillet fra Environmental Water Prøver

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Karakterisering og anvendelse af passive samplere for Overvågning af pesticider i vand

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Udvinding og karakterisering af overfladeaktive fra atmosfæriske aerosoler

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måling og kortlægning mønstre af jorderosion og Deposition relateret til jordbunden karbonat koncentrationer Under landbrugsdrift

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Kollektion og udvinding af erhvervsmæssig Luftprøver til analyse af svampe DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Karakterisering af akvatiske biofilm med flowcytometri

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Kvantificere plante opløseligt Protein og fordøjeligt kulhydrat indhold, ved hjælp af majs (Zea mays) som en eksemplarisk

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Påvisning af Tilapia søen Virus ved hjælp af konventionelle RT-PCR og SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...