Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Financiering en ondersteuning werden verstrekt door de afdeling scheikunde aan de Michigan State University.

1. stamoplossingen voorbereiding voor het gieten van inheemse groene Gels
<ol><li>Bereiden een 4 x geconcentreerd bufferoplossing voor het oplossen van gel bestaande uit 40% glycerol, glycine van 200 mM en 100 mM Tris gebufferd op een pH van 8,3.</li>
	<li>Een 4 x geconcentreerd bufferoplossing voorbereiden stapelen gels, bestaande uit 40% glycerol, glycine van 200 mM en 100 mM Tris gebufferd op een pH van 6.3.</li>
	<li>Bewaar deze buffers bij 4 ° C om te voorkomen dat de groei van de schimmel. Opmerking: De buffe...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

Een succesvolle thylakoïde solubilisatie en native gel uitvoeren zal resulteren in de resolutie van meerdere afzonderlijke zichtbaar groene banden op de gel zonder aanzienlijke vervorming of het smeren van de bands. Overbelasting de gel, een hoge concentratie van wasmiddel, een onjuiste monster pH, onopgeloste materiaal, runnen van de gel te snel of bij een te hoge temperatuur, en een ten onrechte gegoten gel zijn allemaal factoren die kunnen bijdragen tot slecht opgelost thylakoïde complexen. Terwijl het optimaliseren...

Fotosynthetische organismen moeten voortdurend hun fysiologie aan veranderende milieu omstandigheden hun productiviteit te maximaliseren en met succes concurreren met buren1aanpassen. Dit geldt met name voor de machine verantwoordelijk voor de licht-reacties van fotosynthese, als omgevingslicht voorwaarden door drie ordes van grootte tussen donker en vol zonlicht fluctueren kunnen. Bovendien, kunnen milieufactoren zoals droogte, koude of hittestress verminderen de beschikbaarheid van kooldioxide voor fixatie van koolstof, die de natuurlijke elektron gootsteen voor de producten van de licht-reacties. Planten moeten, daarom, oogst en gebruik maken van de zonnestraling zo efficiënt mogelijk met behoud van de mogelijkheid om te verdrijven van overtollige licht energie als dit nodig is. Terwijl photooxidative schade nog steeds routinematig onder alle lichtomstandigheden2,3, onvermogen om te beheren energie van de geabsorbeerde excitatie met succes kan leiden tot de catastrofale celbeschadiging en dood optreedt. Verschillende adaptieve mechanismen bestaan waarmee de fotosynthetische toestellen worden afgesteld zowel aan veranderingen in de heersende milieuomstandigheden en voorbijgaande fluctuaties (dat wil zeggen, over zowel de korte als de lange termijn)4. Het gaat hierbij om de lange termijn response (LTR) en niet-fotochemische blussen (NPQ). NPQ is zelf geacht te omvatten ten minste drie andere component fenomenen, waaronder staat overgangen (qT), snel afleidbare energie blussen (qE) en photoinhibition (qI)5.
Deze processen werden oorspronkelijk waargenomen en grotendeels in termen van spectroscopische fenomenen gedefinieerd [bijvoorbeeld NPQ verwijst naar een daling in waargenomen chlorofyl fluorescentie (blussen van chlorofyl fluorescentie) thats niet te wijten aan een toename in de snelheid van Fotochemie]6. De term "overgangen van de staat" ook naar de waargenomen verwijst verandering in de relatieve hoeveelheid fluorescentie van PSI en PSII7. Terwijl de spectroscopische technieken die opsomming van deze verschijnselen mogelijk hebben gemaakt [inzonderheid pulse amplitude gemoduleerd (PAM) Fluorescentiespectroscopie] en blijven een essentieel middel voor het observeren en het ontleden van fotosynthetische processen in vivo, veel van de biochemie is vereist voor het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze spectroscopische waarnemingen. Staat overgangen, bijvoorbeeld, houdt een fosforylatie/defosforylerings-cyclus van de LHCII eiwitten door de STN7 kinase en fosfatase TAP38/PPH1, respectievelijk8,9,10. Deze cyclus regelt de fysieke distributie van de antenne van de LHCII tussen de twee photosystems door een deel van LHCII trimeren van PSII naar PSI, waardoor het wijzigen van de absorptie dwarsdoorsnede van de photosystems11,12. De qE component van NPQ zet snel overtollige excitatie energie in warmte door middel van de acties van de Violaxanthine/zeaxanthine epoxidatie/de-epoxidatie cyclus en de publieke omroepen-eiwit. De exacte rol van publieke omroepen in dit proces is nog steeds niet volledig begrepen13. De component van de qI van NPQ, photoinhibition, wordt over het algemeen toegeschreven om schade aan de proteïne van de D1 van PSII. Herstel van volledige fotosynthetische bevoegdheid vereist een uitgebreide herstelproces te repareren van beschadigde PSII photocenters. De PSII reparatie cyclus omvat de migratie van PSII complexen uit de granal stapels, ontmanteling van de complexen, vervanging van beschadigde D1 eiwitten, opnieuw samenstellen van de complexen PSII en verkeer van PSII complexen terug naar de granal stapels14. De precieze aard van de photoinhibition en PSII photodamage blijft een onderwerp van intensieve controle15.
De moeilijkheid bij het bestuderen van verschijnselen als staat overgangen of PSII reparatie vloeit gedeeltelijk voort uit het feit dat er niet een eenvoudige manier is te visualiseren van de mechanica van complexe biochemische systemen. De klassieke biochemische aanpak voor het begrip van een proces is het eerst scheiden van zijn onderdelen, zodat ze kunnen worden gekarakteriseerd in isolatie. Native gelelektroforese is ontstaan uit de succesvolle pogingen in de jaren 1980 te scheiden en karakteriseren de Fotosysteem complexen van de thylakoïde membranen met meer voorbereidende methoden (namelijk sacharose kleurovergang centrifugeren en chromatografie)16. Het wasmiddel systemen ontwikkeld om het zachtjes solubilize de inheemse complexen van de membranen thylakoïde werden snel aangepast aan elektroforetische scheidingsmethoden, vooral door Allen en article17 en en Peter en Thornber18, leiden aan inheemse groene gelelektroforese. Hoewel vertegenwoordigen slechts één uit een verscheidenheid van technieken in het experimentele arsenaal, inheemse pagina een aantal aantrekkelijke kenmerken die een algemeen werkzame methode hebben gemaakt in het onderzoek van de fotosynthese heeft. Inheemse pagina is relatief snel en eenvoudig, waarbij weinig gespecialiseerde apparatuur, terwijl het verstrekken van hoge resolutie scheiding van een groot aantal thylakoïde complexen gelijktijdig. Dit zorgt ervoor dat inheemse pagina een handig hulpmiddel voor de studie van thylakoïde dynamiek en, in combinatie met standaard pagina in de tweede dimensie, alsmede een verscheidenheid van wasmiddel en buffer systemen, een veelzijdig systeem voor het zoeken en karakterisering van nieuwe thylakoïde complexen.
Dat gezegd zijnde, hebben inheemse groene gels een reputatie als een onbetrouwbare techniek, met name in onervaren handen, omdat het gemakkelijk is voor de productie van slechte resultaten vage, smeary gels met enkele bands uit. Dit probleem werd opgelost, gedeeltelijk, met de introductie van blauw-native pagina19. Het gebruik van coommassie kleurstof in de BN buffersysteem maakt eiwit scheiding robuuster. Daarom kan BN-pagina is vaak een gemakkelijker en betrouwbaarder techniek voor een relatieve beginner instellen en hoge resolutie scheidingen van thylakoïde complexen. Om deze redenen geworden BN-pagina de methode van keuze voor het meeste werk voor dit veld. Terwijl BN-pagina over het algemeen langzamer is uitgevoerd dan groene gelelektroforese, het belangrijkste nadeel is dat de coommassie kleurstof kleuring interfereert met de identificatie van zwakke chlorofyl-bevattende bands, terwijl ook downstream spectroscopische karakterisering problematisch.
De biochemische informatie verstrekt door inheemse gels en 2D SDS-pagina kan aanzienlijk worden versterkt in combinatie met gegevens van spectroscopische technieken. Ongeacht het systeem, een centraal probleem met het gebruik van inheemse gels te identificeren complexen is dat er altijd de identificatie kan worden aangevochten (dat wil zeggen, de eiwitten in een band gevonden kan altijd vertegenwoordigen comigrating complexen of onderdelen, eerder dan een enkel fysiologisch authentiek complex). Spectroscopische karakterisering biofysische informatie over de pigmenten in groene gel bands en kan worden gebruikt om te bepalen welke soorten complexen zijn ze waarschijnlijk bevatten. Chlorofyl fluorescentie is vooral nuttig in dit verband als gevolg van de vaak sterk verschillende spectra en de levensduur van de fluorescentie die karakteristiek voor verschillende fotosynthetische pigment-eiwitcomplexen zijn. Terwijl eenvoudige steady-state 77K fluorescentie spectra historisch nuttig zijn bij de bevestiging van de identiteit van de inheemse gel complexen, bieden moderne tijd-gecorreleerde één foton tellen (TCSPC) veel meer informatie. TCSPC kunnen niet alleen de karakterisatie van complexen op basis van de levensduur van de fluorescentie, maar maakt ook mogelijk de gedetailleerde beschrijving van de energie-overdracht tussen spectrale componenten binnen een complex. Dit soort karakterisering wordt steeds noodzakelijker als het gebruik van verschillende inheemse gel systemen spreads en nieuwe putatief complexen worden ontdekt, waardoor de identificatie van eiwitcomplexen beter worden geverifieerd en het verstrekken van nieuwe biofysische informatie over de werking van deze complexen.
In dit document bieden we een methode waarmee degenen die weinig of geen ervaring met inheemse gelelektroforese om de resolutie van de hoge kwaliteit van inheemse thylakoïde complexen met het oog op het onderzoek naar de mechanica van de licht-reacties van fotosynthese. Deze basistechniek kan vervolgens worden opgedreven naar eigen goeddunken van de experimentator resultaten verbeteren of uitbreiden van toepasselijkheid op andere soorten. Vervolgens beschrijven we het proces voor het onderwerpen van inheemse groene gel bands aan het TCSPC, evenals enkele stappen voor fundamentele analyse en betere presentatie van de gegevens verstrekt door de techniek. De koppeling van de inheemse gelelektroforese met TCSPC analyse breidt het nut van deze gel-systemen door middel van verificatie en biofysische karakterisering van eiwitcomplexen binnen de bands. Het systeem van de groene gel hier beschreven is gebaseerd op die ontwikkeld door Allen en article17 met enkele wijzigingen en is hetzelfde als die in Schwarz et al.gebruikt. 20. dit systeem is een van de vele maar heeft specifieke functies die handig voor deze methode zijn. Het is snel genoeg, zodat thylakoïde isolatie, de gelelektroforese van het en TCSPC analyse handige kunnen worden uitgevoerd op één dag wegnemen van mogelijke problemen van monster opslag en afbraak. Wij vinden ook dat deze methode robuust in de handen van onervaren gebruikers, is terwijl nog steeds resultaten die variëren van goede naar superior, afhankelijk van de mate van optimalisatie.
Het is belangrijk om te beseffen dat de gevisualiseerd op een native gel complexen afhankelijk zijn op zowel het wasmiddel en buffer systemen die worden gebruikt, alsook op de biologische eigenschappen van het organisme onderzocht. Verschillende systemen van wasmiddel en buffer scheiden bij voorkeur verschillende soorten complexen, en een bepaalde fotosynthetische organisme zal hebben verschillende complexen van andere organismen, niet alle die aanwezig zijn in een bepaalde omstandigheid zal zijn. Het systeem hier beschreven is bijzonder geschikt voor de studie van PSI megacomplexes, zoals beschreven in Schwarz et al.. 20, maar het valt op de meer destabiliserende kant van het spectrum voor degenen die studeren van PSII megacomplexes. Voor een uitgebreide studie van de verschillende systemen voor wasmiddel en buffer gebruikt in native gelelektroforese van thylakoïde eiwitten, is het aanbevolen om Järvi et al.bekijken. 21 en Rantala et al. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

De licht-reacties van fotosynthese worden uitgevoerd door een reeks van gepigmenteerde eiwitcomplexen in de thylakoïde membranen. De stoichiometrie en de organisatie van deze complexen op zowel lange als korte tijd schalen als gevolg van de processen die aan te passen aan veranderende milieu omstandigheden fotosynthese hoogdynamische is (dat wil zeggen, niet-fotochemische blussen, staat de overgangen, en de op lange termijn antwoord). Historisch, deze processen zijn beschreven spectroscopically in termen van veranderingen in de chlorofyl fluorescentie en spectroscopie blijft een belangrijke methode voor het fotosynthetische controleparameters. Er zijn een beperkt aantal manieren waarin de onderliggende complexe dynamiek van de eiwitten kunnen worden gevisualiseerd. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode voor het hoge-resolutie scheiding en visualisatie van thylakoïde complexen, inheemse groene gelelektroforese. Deze methode gaat gepaard met tijd-gecorreleerde één foton tellen voor gedetailleerde karakterisering van de chlorofyl fluorescentie-eigenschappen van bands gescheiden op de groene gel.

Representatieve resultaten voor groene gelelektroforese worden gepresenteerd in Figuur 1. Lane 1 bevat een voorbeeld van ideale resultaten voor groene gelelektroforese van spinazie ze, waarin een maximum aantal heldere, scherpe groene banden zichtbaar zijn. Deze resultaten zijn enigszins atypisch, gedeeltelijk omdat niet alle van de bands gezien in baan 1 normaal aanwezig zijn in een monster zijn. Extra monster opruimen, in de vorm van chloroplast isolatie vo...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Hier presenteren we een protocol om te scheiden van ontbindend thylakoïde complexen door Native groen gelelektroforese. Groene gel banden worden vervolgens gekenmerkt door tijd gecorreleerd Single Photon Counting (TCSPC) en basisstappen voor data-analyse worden verstrekt.

Scheiding van spinazie thylakoïde eiwitcomplexen door elektroforese van het Gel van de Native groen en karakterisering van de Band met Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Deze methode is nuttig voor het beantwoorden van bepaalde belangrijke vragen op het gebied van fotosynthese onderzoek, zoals putatieve thylakoïde complexen fysiologisch echte complexen met energetisch verbonden componenten? Het belangrijkste voordeel van de groene gel en TCSPC protocol hier beschreven is dat het snel en robuust. Monsters kunnen eenvoudig worden verwerkt en geanalyseerd in een enkele dag, waardoor problemen van opslag en stabiliteit minder een punt van zorg.Hoewel TCSPC inzicht kan geven in de fotosynthetische systemen die we hier hebben bestudeerd, kan het ook worden toegepast op andere systemen, variërend van chemische tot fysische en biologische, zoals studies van fluorescerende moleculaire beweging in vloeistoffen, cellen of nieuw-structurele motieven zoals monomoleculaire lagen en ionische vloeistoffen. Om deze procedure te beginnen, bereid de benodigde voorraadoplossingen en groene minigels zoals beschreven in het tekstprotocol. Vervolgens, het verkrijgen van wat ijs en dim de lichten.Met behulp van een glazen Dounce homogenisator, volledig homogeniseren de spinazie bladeren in ongeveer een tot twee milliliter TMK buffer. Als u een eenvoudig filterapparaat wilt maken, snijdt u een delicate taak doormidden en vouwt u deze in kwarten. Verwijder de zuiger uit een spuit en pak de gevouwen taak in de bodem van de spuit.Pipette het blad homogenaat in het midden van de taak-veeg filter, gebruik dan de zuiger om het homogenaat door het filter en het verzamelen in een 1,5-milliliter centrifuge buis. Centrifugeer het homogenaat op 5,000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het onoplosbare materiaal, inclusief de thylakoïde membranen, te pelleteren. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in een milliliter TMK-buffer.Om chlorofyl uit elk monster te halen, neem je een aliquot van 50 microliter en breng je het over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 950 microliter methanol toe, dop de buis en meng door het meerdere keren om te keren. Centrifuge op 10,000 g gedurende 10 minuten om de neergeslagen eiwitten te pelleteren.Met behulp van de chlorofylconcentratie metingen als een gids, verwijderen en gooi wat volume uit elk monster indien nodig totdat elke buis bevat dezelfde totale hoeveelheid chlorofyl. Centrifuge 10 minuten lang op 5,000 g om de thylakoïde membranen opnieuw te pelleteren. Verwijder en gooi de supernatant, voorzichtig om alle supernatant te verwijderen zonder de pellet te verstoren.Ontdooi eerst een aliquot van TMK 30%glycerol wasmiddeloplossing. Keer meerdere keren om te mengen en houd de oplossing op ijs. Voeg een passend volume van de wasmiddeloplossing toe om de pellet op te lossen en resulteren in een uiteindelijke chlorofylconcentratie van één milligram per milliliter.Pipet herhaaldelijk op en neer terwijl voorzichtig om schuim in het monster te voorkomen. Houd vervolgens het monster op ijs om thylakoïde monsters te laten oplosen. Nadat de oplosting is voltooid, centrifugeer het monster op 10, 000 g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het onoplosbare materiaal te pelleteren, wat resulteert in een helder, donkergroen supernatant.Laad hierna 15 microliter oplosbaar thylakoïde supernatant direct op elke put van een eerder voorbereide 1,5-millimeter inheemse gel. Met behulp van 1X lopende buffer, beginnen met het uitvoeren van de native groene gel op 100 volt. Plaats de hele gel tank op nat ijs voor de duur van de run om weerstand te beperken verwarming.Wanneer de gel klaar is met lopen, verwijder deze uit de elektroforese cel en spoel de loopbuffer af van de gelplaten met gedestilleerd water. Haal de bovenste plaat uit de gel en spoel de gel af met gedestilleerd water. Plaats de gel, die nog steeds op de onderste glasplaat, op ijs;wanneer de gel niet in gebruik is, bedek het met plastic folie en houd het in het donker om te voorkomen dat het uitdrogen.Gebruik vervolgens een scherpe scalpel of scheermesje om elke groep van belang te verduisteren wanneer ze klaar zijn om verder te gaan met de TCSPC-analyse. Zorg ervoor dat de uitgesneden band geen vervuilend bandmateriaal bevat. Gebruik voor elk complex dat wordt geanalyseerd een fluorescerende spectrometer om een fluorescerend spectrum op kamertemperatuur te maken tussen 600 en 800 nanometer.Plaats plakband op beide zijden van de dia's en vouw het meerdere malen om spacers te creëren, waardoor de dia's stevig bij elkaar kunnen worden gehouden zonder de ruimte tussen te comprimeren, en vervolgens de gelschijf tussen twee glazen microscopiedia's sandwich. Voeg een kleine hoeveelheid water toe aan de gelschijf aan de rand van de glazen platen om een vloeiende interface te creëren die de signaalverstrooiing vermindert. Klem vervolgens de gelsandwich in het balkpad, zodat de balk de gelschijf door de open rand van de platen raakt.Verzamel voor elk complex 10.000 totale gegevenspunten op regelmatige tijdstippen over het fluorescentieemissiespectrum. Om de gegevens voor een bepaald complex te analyseren, normaliseert u eerst de piekhoogte van elke vervalcurve voor alle verzamelde golflengten en komt de staart overeen met elke vervalcurve met het steady state fluorescentiespectrum van het complex zoals beschreven in het tekstprotocol. Representatieve resultaten voor de groene gel elektroforese geeft een voorbeeld van een ideaal resultaat voor de analyse van spinazie thylakoïden, waar een aantal heldere, scherpe groene banden zichtbaar zijn.Rijstroken 2 en 3 geven meer typische resultaten van eenvoudige thylakoïde isolatie en elektroforese op een niet-gradiënt 5%acrylamide gel. Rijstroken 4, 5 en 6 geven een voorbeeld van slechte resultaten als gevolg van toenemende graden van onder oplosbare steekproef, terwijl baan 7 de resultaten laat zien die kunnen worden bereikt wanneer Arabidopsis thylakoïden worden gebruikt in plaats van spinazie. Nadat de gegevenscurven van de TCSPC-gegevens zijn ingesteld op hetzelfde tijdregister, kunnen ze worden genormaliseerd tot dezelfde piekhoogte, waardoor de curven kunnen worden vergeleken als een eerste analyse van de gegevens.Piek-genormaliseerde verval bochten van verschillende complexen kunnen dan worden bedekt met elkaar op een bepaalde golflengte, waardoor de verschillen in gedrag tussen de complexen worden gevisualiseerd. Staart die de bederfkrringen aan het passen past maakt de bouw van verval-bijbehorende spectra mogelijk. Zoals hier te zien, het verval-geassocieerde spectra voor de LHCII is opmerkelijk voor het gebrek aan dynamische functies en de vorm van de LHCII fluorescentie spectrum blijft hetzelfde als het signaal vervalt na verloop van tijd.Het verval van het fluorescentiespectrum wordt ook vertraagd, waardoor 100 picoseconden nodig zijn om maximale fluorescentie te bereiken. Dit suggereert dat energie niet wordt overgedragen tussen energetisch verschillende pigmenten binnen het complex als de fluorescentie vervalt. Het verval-geassocieerde spectra wordt vervolgens gebouwd voor de Band 5 complex.Vergeleken met de LHCII, de fluorescentie van Band 5 vervalt veel sneller, het bereiken van maximale intensiteit in slechts 30 picoseconden en vervolgens vervallen tot minder dan 20% van de initiële intensiteit na 500 picoseconden. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de interpretatie van de TCSPC-gegevens zal afhangen van aanvullende biochemische informatie ter identificatie van de componenten van de complexen in studie, bijvoorbeeld door 2 DSDS-PAGE en Western Blotting of massaspectrometrie.

Research

JoVE Journal

Environment

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Karakterisering en toepassing van passieve samplers voor Monitoring van bestrijdingsmiddelen in het water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Extractie en karakterisering van Surfactants van atmosferische aërosolen

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Meten en in kaart brengen van patronen van bodemerosie en afzetting aan de bodem carbonaat concentraties onder beheer van de landbouw gerelateerde

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Collectie en extractie van beroepsmatige Air monsters voor analyse van schimmel DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Karakterisering van aquatische Biofilms met stroom Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Kwantificeren van de Plant oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud, met behulp van maïs (Zea mays) als een Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...