Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
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Financement et le soutien ont été fournis par le département de chimie à la Michigan State University.

1. préparation de Solutions stock pour le coulage des Gels natifs de vert
<ol><li>Préparer un 4 x solution de tampon concentré pour résoudre les gels composé de 40 % de glycérol, glycine de 200 mM et 100 mM Tris tamponnée à pH 8,3.</li>
	<li>Préparer un 4 x solution de tampon concentré pour empilage gels composé de 40 % de glycérol, glycine de 200 mM et 100 mM Tris tamponnée à pH 6,3.</li>
	<li>Stocker ces tampons à 4 ° C pour empêcher la croissance de moisissures. Remarque : Les tampons sont stabl...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

Une solubilisation de thylakoïdes réussie et le gel natif exécuter seront traduira par la résolution de plusieurs bandes distinctes de verts visibles sur le gel sans distorsion importante ou bavures des bandes. Surcharge le gel, une forte concentration de détergent, un pH de l’échantillon incorrect, non dissous matériel, tourne le gel trop rapidement ou à une température trop élevée, et un gel mal coulé sont autant de facteurs qui peut-être contribuer aux complexes de thylakoïdes mal résolus. Tout en opt...

Les organismes photosynthétiques doivent ajuster en permanence leur physiologie à l’évolution des conditions environnementales afin de maximiser leur productivité et soutenir la concurrence avec les voisins de1. Ceci est particulièrement vrai pour le mécanisme responsable des lumière des réactions de photosynthèse, comme la lumière ambiante conditions peuvent fluctuer de trois ordres de grandeur entre les ombres et plein soleil. En outre, les facteurs environnementaux tels que la sécheresse, froid ou de chaleur peuvent réduire la disponibilité de dioxyde de carbone pour la fixation du carbone, qui est l’évier électron naturelle pour les produits des réactions lumière. Plantes doivent, par conséquent, récolter et utiliser le rayonnement solaire aussi efficacement que possible tout en conservant la capacité de dissiper le surplus d’énergie lumineuse que nécessaire. Tandis que photooxidative dommages se produisent encore régulièrement au titre de l’ensemble de conditions de lumière2,3, incapacité à gérer les énergie d’excitation absorbé avec succès peut conduire à la lésion des cellules catastrophique et la mort. Plusieurs mécanismes d’adaptation existent qui permettent à l’appareil photosynthétique à accorder aux changements de conditions d’environnement, tant à des fluctuations transitoires (p. ex., sur des échelles de temps longues et courtes)4. Il s’agit de la réponse à long terme (LTR) et non photochimique trempe (QNP). QNP est lui-même considéré comme pour englober au moins trois autres phénomènes de composant, y compris les transitions d’État (qT), trempe rapidement inductible de l’énergie (qE) et photoinhibition (qI)5.
Ces processus ont été initialement observés et définis en grande partie en termes de phénomènes spectroscopiques [p. ex. QNP se réfère à une goutte d’eau dans la fluorescence de la chlorophylle observés (extinction de fluorescence de la chlorophylle) qui n’est pas due à une augmentation du taux de photochimie]6. « Les transitions d’état » de la même façon on entend le changement observé dans la quantité relative de la fluorescence du PSI et PSII7. Alors que les techniques spectroscopiques qui ont fait l’énumération de ces phénomènes possible [en particulier, la spectroscopie de fluorescence (PAM) modulation d’amplitude d’impulsion] et continuent d’être un moyen vital d’observation et dissection photosynthétiques processus dans Vivo, beaucoup de biochimie est nécessaire afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent ces observations spectroscopiques. Transitions de l’États, par exemple, implique un cycle de phosphorylation/déphosphorylation des protéines LHCII par la protéine kinase STN7 et TAP38/PPH1 phosphatase, respectivement8,9,10. Ce programme permet de régler la distribution physique de l’antenne LHCII entre les deux photosystèmes en déplaçant une partie des trimères LHCII de PSII au PSI, modifiant ainsi l’absorption coupe transversale des photosystèmes11,12. Le composant qE de QNP se transforme rapidement en énergie d’excitation excessive en chaleur par l’intermédiaire de l’action de la violaxanthine/zéaxanthine époxydation/de-époxydation cycle et la protéine de l’OSP. Le rôle exact des organes subsidiaires principaux dans ce processus, c’est pas encore pleinement compris13. Le composant de qI de QNP, photoinhibition, est généralement attribué aux dommages à la protéine D1 du PSII. Restauration de compétence pleine photosynthèse nécessite un processus de réparation complexe pour résoudre endommagé photocenters PSII. Le cycle de réparation PSII implique la migration des complexes PSII hors les piles contiennent, démantèlement des complexes, remplacement des protéines endommagées de D1, remontage des complexes PSII et mouvement des complexes PSII dans les piles contiennent14. La nature exacte de la photoinhibition et PSII photovieillissement reste un objet d’un examen minutieux,15.
Les transitions de la difficulté à étudier des phénomènes comme l’état ou la réparation PSII découle en partie du fait qu’il n’y a pas un moyen simple de visualiser la mécanique des systèmes biochimiques complexes. L’approche biochimique classique pour comprendre un processus consiste à séparer ses composants afin qu’ils peuvent être caractérisés en vase clos. Électrophorèse sur gel natif découle d’efforts couronnés de succès dans les années 1980 à séparer et à caractériser les complexes de photosystème des membranes thylakoïdes avec plusieurs méthodes préparatives (centrifugation en gradient de saccharose et chromatographie)16. Les détergents systèmes développés pour solubiliser doucement les complexes natives des membranes thylakoïdes étaient bientôt adaptés aux méthodes de séparation par électrophorèse, plus particulièrement par Allen et Staehelin17 et et Peter et Thornber18, donnant lieu électrophorèse sur gel vert natif. Alors que le seul représentant de diverses techniques dans l’arsenal expérimentale, natif de PAGE a un certain nombre de caractéristiques attrayantes qui en ont fait une méthode couramment employée dans la recherche de la photosynthèse. PAGE native est relativement rapide et simple, nécessitant des équipements peu spécialisés, tout en assurant simultanément la séparation de haute résolution d’un grand nombre de complexes de thylakoïdes. Cela rend PAGE native, un outil pratique pour l’étude dynamique des thylakoïdes et, lorsqu’il est combiné avec une PAGE standard dans la deuxième dimension, mais aussi une variété de systèmes de détergent et de la mémoire tampon, un système polyvalent pour la trouver et la caractérisation de nouveaux complexes de thylakoïdes.
Cela étant dit, gels verts natifs ont eu la réputation d’être une technique peu fiable, en particulier dans des mains inexpérimentées, tel qu’il est facile de produire des résultats médiocres, consistant en des gels floues, graisseux avec peu de bandes. Ce problème a été résolu, en partie, avec l’introduction de bleu-indigène PAGE19. L’utilisation de colorant coommassie dans le système de tampon ne rend la séparation de protéines plus robustes. Par conséquent, BN-PAGE est souvent une technique plus facile et plus fiable pour un novice relative à mettre en place et peut fournir des séparations de haute résolution de thylakoïdes complexes. Pour ces raisons, BN-PAGE est devenu la méthode de choix pour la plupart des travaux de ce champ. BN-PAGE est généralement plus lente à gérer que l’électrophorèse sur gel vert, son inconvénient principal est que la coloration coommassie interfère avec l’identification de faibles bandes contenant de la chlorophylle, tout en s’en aval spectroscopiques caractérisation de problématique.
L’information biochimique fournie par gels natifs et SDS-PAGE 2D peut être considérablement renforcée lorsqu’il est combiné avec les données techniques spectroscopiques. Quel que soit le système utilisé, un problème central avec l’aide de gels natifs pour identifier des complexes est que l’identification peut toujours être contestée (c'est-à-dire, les protéines trouvées dans une bande pourrait toujours représenter complexes migrent ou composants, plutôt qu’un seul complexe physiologiquement authentique). Caractérisation spectroscopique fournit des informations biophysiques sur les pigments dans les bandes de gel vert et peut être utilisée pour déterminer quels types de complexes, elles sont susceptibles de contenir. Fluorescence de la chlorophylle est particulièrement utile à cet égard en raison de la souvent radicalement différents spectres et les durées de vie de fluorescence qui sont caractéristiques des complexes protéiques-pigment photosynthétique. Alors que les spectres de fluorescence simple équilibre 77K ont été historiquement utiles pour confirmer l’identité des complexes de gel natif, moderne temps-corrélé de photon unique comptant (TCSPC) peut fournir beaucoup plus d’informations. TCSPC permet non seulement de la caractérisation des complexes basées sur des durées de vie de fluorescence, mais rend aussi possible la description détaillée du transfert d’énergie entre les composantes spectrales au sein d’un complexe. Ce genre de caractérisation devient de plus en plus nécessaire que l’utilisation des différents systèmes "spreads" de gel natif et nouveaux complexes putatifs sont découverts, permettant l’identification des complexes de protéines doivent être mieux authentifiées et offrant de nouvelles données biophysiques sur le fonctionnement de ces complexes.
Dans cet article, nous fournissons une méthode qui permet à ceux ayant peu ou pas d’expérience avec électrophorèse native de parvenir haute qualité de thylakoïdes native complexes aux fins de l’enquête sur les mécanismes des réactions de lumière photosynthèse. Cette technique de base peut ensuite être augmentée à la discrétion de l’expérimentateur pour améliorer les résultats ou étendre l’applicabilité à d’autres espèces. Nous décrivons ensuite le processus pour soumettre les bandes de gel vert natif à TCSPC, ainsi que quelques étapes de base analyse et présentation des données fournies par la technique. Le couplage de l’électrophorèse sur gel natif avec analyse TCSPC étend l’utilité de ces systèmes de gel en fournissant l’authentification et la caractérisation biophysique des complexes protéiques dans les bandes. Le système de gel vert décrit ici repose sur développé par Allen et Staehelin17 avec quelques modifications, qui est le même que celui utilisé dans Schwarz et coll.. 20. ce système est un des nombreux mais a des spécificités qui sont utiles pour cette méthode. C’est assez rapide pour que l’isolement des thylakoïdes, électrophorèse sur gel et TCSPC analyse pratique peuvent être effectuées en une seule journée, il ne soit pas des problèmes potentiels de conservation de l’échantillon et de la dégradation. Nous constatons également que cette méthode est robuste dans les mains des utilisateurs inexpérimentés, tout en offrant des résultats qui vont du bon au supérieur, selon le degré d’optimisation.
Il est important de garder à l’esprit que les complexes visualisées sur un gel natif dépendant sur le détergent et le tampon des systèmes utilisés, ainsi que sur la biologie de l’organisme incriminé. Différents systèmes de détergent et tampon préférentiellement séparent différents types de complexes, et un organisme photosynthétique donné auront différents complexes provenant d’autres organismes, pas ce qui se présentera sous aucune circonstance donnée. Le système décrit ici est particulièrement adapté à l’étude des megacomplexes PSI, comme décrit dans Schwarz et al. 20, mais il tombe sur la fin plus déstabilisante du spectre pour ceux qui étudient la PSII megacomplexes. Pour une étude approfondie des différents systèmes de détergent et de la mémoire tampon utilisée en électrophorèse native des protéines des thylakoïdes, il est recommandé de revoir Järvi et al. 21 et Rantala et al. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

Les réactions de la lumière de la photosynthèse sont effectuées par une série de complexes de protéine pigmentée dans les membranes des thylakoïdes. La stoechiométrie et l’organisation de ces complexes est très dynamique sur long et des échelles de temps courtes en raison de processus qui s’adaptent à la photosynthèse à l’évolution des conditions environnementales (c.-à-d. non photochimique trempe, les transitions d’État et le réponse à long terme). Historiquement, ces processus ont été décrits par spectroscopie en fonction des changements dans la fluorescence de la chlorophylle, et spectroscopie reste une méthode indispensable pour la surveillance des paramètres photosynthétiques. Il y a un nombre limité de façons dont la dynamique complexe de protéine sous-jacentes peut être visualisée. Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour la séparation à haute résolution et la visualisation des thylakoïdes complexes, électrophorèse sur gel vert natif. Cette méthode est couplée avec le temps-corrélé de photon unique comptant pour une caractérisation détaillée des propriétés de fluorescence de la chlorophylle de bandes séparées sur le gel vert.

Les résultats représentatifs pour l’électrophorèse de gel vert sont présentés dans la Figure 1. Lane 1 fournit un exemple des résultats idéaux pour l’électrophorèse de gel vert des épinards thylakoïdes, dans lequel un nombre maximal de bandes vertes claires et nettes est visible. Ces résultats sont quelque peu atypiques, en partie parce que pas toutes les bandes vus en piste 1 sont normalement présents dans un échantillon donné. Nettoyage ...

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Nous présentons ici un protocole visant à séparer les thylakoïdes solubilisée complexes par électrophorèse sur Gel natif de vert. Gel vert bandes sont caractérisés par la suite par temps en corrélation unique Photon Counting (TCSPC) et les étapes de base pour l’analyse de données sont fournis.

Séparation des épinards thylakoïdes Complexes des protéines par électrophorèse de Gel vert natif et caractérisation de bande en utilisant le comptage de Photon unique Time-Correlated

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Cette méthode est utile pour répondre à certaines questions clés dans le domaine de la recherche sur la photosynthèse, comme le sont les complexes thylakoïdes putatifs physiologiquement réels avec des composants énergétiquement connectés? Le principal avantage du gel vert et du protocole TCSPC décrit ici est qu’il est rapide et robuste. Les échantillons peuvent facilement être traités et analysés en une seule journée, ce qui rend les questions d’entreposage et de stabilité moins préoccupantes.Bien que TCSPC puisse fournir un aperçu des systèmes photosynthétiques que nous avons étudiés ici, il peut également être appliqué à d’autres systèmes allant du produit chimique au physique et biologique tels que les études du mouvement moléculaire fluorescent dans les liquides, les cellules, ou les motifs nouveaux-structurels tels que les couches monomoléculaires et les liquides ioniques. Pour commencer cette procédure, préparez les solutions de stock nécessaires et les mini gels verts tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Ensuite, obtenir de la glace et éteindre les lumières.À l’aide d’un homogénéisateur dounce en verre, homogénéiser complètement les feuilles d’épinards dans environ un à deux millilitres de tampon TMK. Pour créer un simple dispositif de filtrage, coupez une tâche délicate essuyez-la en deux et pliez-la en quartiers. Retirez le piston d’une seringue, puis emballez l’effacement plié dans le fond de la seringue.Pipette la feuille homogénéise au centre du filtre d’effacement des tâches, puis utilisez le piston pour passer l’homogénéité à travers le filtre et le recueillir dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifugeuse l’homogénéisation à 5000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter le matériau insoluble, y compris les membranes thylakoid. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en un millilitre de tampon TMK.Pour extraire la chlorophylle de chaque échantillon, prenez un aliquot de 50 microlitres et transférez-la dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter 950 microlitres de méthanol, capuchon le tube, et mélanger en l’inversant plusieurs fois. Centrifugeuse à 10 000 g pendant 10 minutes pour granuler les protéines précipitées.À l’aide des mesures de concentration de chlorophylle comme guide, retirez et jetez un peu de volume de chaque échantillon au besoin jusqu’à ce que chaque tube contienne la même quantité totale de chlorophylle. Centrifugeuse à 5000 g pendant 10 minutes pour re-pelleter les membranes thylaïdes. Retirer et jeter le supernatant, en prenant soin d’enlever tout le surnatant sans déranger la pastille.Tout d’abord, décongeler un aliquot de TMK 30% solution de détergent glycérol. Inverser plusieurs fois pour mélanger et garder la solution sur la glace. Ajouter un volume approprié de la solution de détergent pour dissoudre la pastille et entraîner une concentration finale de chlorophylle d’un milligramme par millilitre.Pipette de haut en bas à plusieurs reprises tout en prenant soin d’éviter de mousser dans l’échantillon. Ensuite, gardez l’échantillon sur la glace pour permettre aux échantillons de thylakoid de solubiliser. Une fois la solubilisation terminée, centrifugez l’échantillon à 10 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler le matériau insoluble, ce qui donne un surnatant vert foncé clair.Après cela, chargez 15 microlitres de supernatant thylakoid solubilized directement sur chaque puits d’un gel indigène précédemment préparé de 1,5 millimètre. À l’aide du tampon de fonctionnement 1X, commencez à exécuter le gel vert indigène à 100 volts. Placez l’ensemble du réservoir de gel sur de la glace humide pendant toute la durée de la course afin d’atténuer le chauffage résistatif.Lorsque le gel a fini de fonctionner, retirez-le de la cellule électrophoresis et rincez le tampon en cours d’exécution des plaques de gel avec de l’eau distillée. Retirer la plaque supérieure du gel, puis rincer le gel à l’eau distillée. Placez le gel, qui est encore sur la plaque de verre inférieure, sur la glace; lorsque le gel n’est pas utilisé, couvrez-le d’une pellicule plastique et gardez-le dans l’obscurité pour l’empêcher de se dessécher.Ensuite, utilisez un scalpel pointu ou une lame de rasoir pour exciser chaque bande d’intérêt lorsqu’il est prêt à procéder à l’analyse tcspc. Assurez-vous que la bande excisée ne contient aucun matériau de bande contaminante. Pour chaque complexe analysé, utilisez un spectromètre fluorescent pour faire un spectre fluorescent à température ambiante entre 600 et 800 nanomètres.Placez du ruban masquant à chaque extrémité des glissières et pliez-le plusieurs fois pour créer des espaceurs, ce qui permettra de tenir fermement les glissières ensemble sans comprimer l’espace entre les deux, puis prendre en sandwich la tranche de gel entre deux diapositives de microscopie en verre. Ajoutez une petite quantité d’eau à la tranche de gel au bord des glissières en verre pour créer une interface lisse qui réduira la diffusion du signal. Ensuite, serrez le sandwich au gel dans le chemin de faisceau de sorte que le faisceau frappe la tranche de gel à travers le bord ouvert des assiettes.Pour chaque complexe, recueillir 10 000 points de données totaux à intervalles réguliers dans tout le spectre des émissions de fluorescence. Pour analyser les données d’un complexe donné, normalisez d’abord la hauteur maximale de chaque courbe de décomposition pour toutes les longueurs d’onde recueillies, puis la queue correspond à chaque courbe de décomposition au spectre de fluorescence à l’état stable du complexe tel que décrit dans le protocole de texte. Les résultats représentatifs de l’électrophoresis gel vert fournit un exemple d’un résultat idéal pour l’analyse des thylakoids épinards, où un certain nombre de bandes claires et nettes vert sont visibles.Les voies 2 et 3 présentent des résultats plus typiques de l’isolement thylakoid simple et de l’électrophoresis sur un gel non-gradient de 5%acrylamide. Les voies 4, 5 et 6 fournissent un exemple de mauvais résultats dus à des degrés croissants de sous-solubilisation de l’échantillon de thylakoid, tandis que la voie 7 démontre les résultats qui peuvent être obtenus quand arabidopsis thylakoids sont utilisés au lieu des épinards. Une fois que les courbes de données des données TCSPC ont été définies dans le même registre de temps, elles peuvent être normalisées à la même hauteur de pointe, ce qui permet de comparer les courbes comme une première analyse des données.Les courbes de décomposition normalisées par pic de différents complexes peuvent ensuite être superposées les unes aux autres à une longueur d’onde donnée, ce qui permet de visualiser les différences de comportement entre les complexes. La queue correspondant aux courbes de décomposition permet la construction de spectres associés à la décomposition. Comme on le voit ici, les spectres associés à la désintégration pour le LHCII sont remarquables par le manque de caractéristiques dynamiques et la forme du spectre de fluorescence LHCII reste la même que les désintégrations du signal au fil du temps.La désintégration du spectre de fluorescence est également retardée, nécessitant 100 picosecondes pour atteindre la fluorescence maximale. Ceci suggère que l’énergie n’est pas transférée entre les pigments énergiquement distincts dans le complexe pendant que la fluorescence se décompose. Les spectres associés à la décomposition sont ensuite construits pour le complexe de la bande 5.Par rapport au LHCII, la fluorescence de la bande 5 se décompose beaucoup plus rapidement, atteignant l’intensité maximale en seulement 30 picosecondes, puis se désintégrer à moins de 20% de l’intensité initiale après 500 picosecondes. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que l’interprétation des données tcspc s’appuiera sur des informations biochimiques supplémentaires identifiant les composants des complexes à l’étude, par exemple, par 2 DSDS-PAGE et Western Blotting ou spectrométrie de masse.

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