Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
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Finanzierung und Unterstützung wurden von der Fakultät für Chemie an der Michigan State University zur Verfügung gestellt.

(1) auf lagerlösungen Vorbereitung für Native grün Gele gießen
<ol><li>Bereiten Sie einem 4-fach konzentrierten Pufferlösung zur Beilegung von Gelen, bestehend aus 40 % Glycerin, 200 mM Glycin und 100 mM Tris, pH 8,3 gepuffert.</li>
	<li>Stacking Gele bestehend aus 40 % Glycerin, 200 mM Glycin und 100 mM Tris gepuffert, pH-Wert von 6,3 bereiten Sie einem 4-fach konzentrierten Pufferlösung vor.</li>
	<li>Speichern Sie diese Puffer bei 4 ° C das Wachstum von Schimmel zu verhindern. Hinweis: Die Puffer sind stab...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. 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L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

Eine erfolgreiche Thylakoidmembran Solubilisierung und native Gel laufen führt die Auflösung der mehrere deutliche sichtbare grüne Bänder auf dem Gel ohne signifikante Verzerrung oder Verschmieren der Bands. Überlasten das Gel, eine hohe Konzentration Waschmittel, eine falsche Beispiel pH-Wert, ungelösten Material, das Gel zu laufen, zu schnell oder bei zu hohen Temperaturen, und eine unsachgemäß gegossene Gel sind alle Faktoren, die zu schlecht gelöst Thylakoidmembran komplexe beitragen können. Bei gleichzeiti...

Photosynthetische Organismen müssen ständig ihre Physiologie an sich verändernde Umweltbedingungen zu maximieren Sie ihre Produktivität und erfolgreich konkurrieren mit Nachbarn1anpassen. Dies gilt insbesondere für die Maschinen verantwortlich für die Licht-Reaktionen der Photosynthese als Umgebungslicht, die Bedingungen um drei Größenordnungen zwischen Schatten und volle Sonne schwanken können. Umweltfaktoren wie Trockenheit, Kälte oder Hitze-Stress können darüber hinaus die Verfügbarkeit von Kohlendioxid für die Kohlenstoffspeicherung, verringern, die das natürliche Elektron für die Produkte der Licht-Reaktionen Waschbecken. Pflanzen müssen deshalb ernten und Sonnenstrahlung möglichst effizient zu nutzen, unter Beibehaltung der Fähigkeit, überschüssige Lichtenergie wie nötig zu zerstreuen. Während photooxidativen Schäden weiterhin routinemäßig unter allen Lichtverhältnissen2,3, Fehler zu verwalten aufgenommene Anregungsenergie erfolgreich zu den katastrophalen Zellschäden und zum Tod führen kann auftritt. Verschiedene Anpassungsmechanismen vorhanden, mit die der photosynthetischen Apparat zu Veränderungen der vorherrschenden Umweltbedingungen und vorübergehende Schwankungen (z.B. über lange und kurze Fristen)4abgestimmt werden können. Dazu gehören die langfristige Reaktion (LTR) und nicht-photochemische abschrecken (NPQ). NPQ ist selbst als umfassen mindestens drei andere Komponente-Phänomene, einschließlich Statusübergänge (qT), schnell induzierbaren Energie abschrecken (qE) und Photoinhibition (qI)5.
Diese Prozesse wurden ursprünglich beobachtet und vor allem in Bezug auf die spektroskopische Phänomene definiert [z. B. NPQ bezieht sich auf einen Tropfen im beobachteten Chlorophyll-Fluoreszenz (abschrecken der Chlorophyll-Fluoreszenz), die nicht durch einen Anstieg der Rate von Photochemie]6. Bezeichnet der Begriff "Statusübergänge" ähnlich der beobachteten Veränderungen in der relativen Höhe der Fluoreszenz von PSI und PSII7. Während die spektroskopischen Techniken, die Aufzählung dieser Phänomene möglich gemacht haben [insbesondere Puls Amplitude moduliert (PAM) Fluoreszenz-Spektroskopie] und weiterhin ein wichtiges Mittel zur Beobachtung und Zergliederung photosynthetische Prozesse in Vivo, viel der Biochemie ist erforderlich, um die Mechanismen, die diese spektroskopischen Beobachtungen zu erhellen. Staatliche Übergänge zum Beispiel beinhaltet einen Phosphorylierung/Dephosphorylation-Zyklus der LHCII Proteine durch die STN7-Kinase und TAP38/PPH1 Phosphatase, jeweils8,9,10. Dieser Zyklus stellt die physische Verteilung der LHCII Antenne zwischen die beiden Photosysteme indem Sie einen Teil des LHCII Trimere von PSII auf PSI, verändert dadurch die Absorption Querschnitt der Photosysteme11,12. Die qE-Komponente des NPQ wandelt schnell überschüssige Anregungsenergie in Wärme durch die Aktionen des Violaxanthin/Zeaxanthin Epoxidierung/de-Epoxidierung Zyklus und die PsbS Protein. Die genaue Rolle des PsbS in diesem Prozess ist noch nicht vollständig verstanden,13. Die qI-Komponente von NPQ, Photoinhibition, wird im allgemeinen zugeschrieben, um Schäden an der D1-Protein des PSII. Wiederherstellung der vollen photosynthetischen Kompetenz erfordert einen aufwendige Reparatur-Prozess, beschädigte PSII Photocenters zu beheben. Die PSII Reparatur-Zyklus umfasst die Migration der PSII komplexe granal Stapel, Abbau der Anlagen, Ersatz der beschädigten D1 Proteine, Zusammenbau der PSII komplexe und Bewegung von PSII komplexe zurück in die granal Stapel14. Die genaue Art des Photoinhibition und PSII lichtbedingten bleibt ein Thema der intensiven Kontrolle15.
Die Schwierigkeit bei der Untersuchung von Phänomenen wie Zustand übergeht oder PSII Reparatur ergibt sich teilweise aus der Tatsache, dass es nicht eine einfache Möglichkeit, die Mechanik des komplexen biochemischen Systemen zu visualisieren. Der klassische biochemische Ansatz zum Verständnis eines Prozesses ist, zunächst seine Bestandteile zu trennen, so dass sie isoliert charakterisiert werden können. Gebürtige Gelelektrophorese entstand aus der erfolgreichen Bemühungen in den 1980er Jahren zu trennen und zu charakterisieren das Photosystem komplexe aus der Thylakoidmembran Membranen mit mehr präparativen Methoden (nämlich Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung und Chromatographie)16. Die Waschmittel Systeme entwickelt, um sanft die native komplexe aus der Thylakoidmembran Membranen lösen wurden bald elektrophoretischen Trennmethoden, vor allem von Allen und Staehelin17 angepasst und und Peter und Thornber18, verursachend zur nativen grünen Gelelektrophorese. Während vertritt nur eine aus einer Vielzahl von Techniken in der experimentellen Arsenal, native Seite eine Reihe von attraktiven Eigenschaften, die es am meisten eingesetzten Methode in der Fotosynthese Forschung haben hat. Native Seite ist relativ schnell und einfach, erfordert wenig Spezialausrüstung, während gleichzeitig hochauflösende Trennung einer großen Anzahl der Thylakoidmembran komplexe. Dies macht native Seite ein praktisches Werkzeug für das Studium der Thylakoidmembran Dynamik und, in Kombination mit standard-Seite in der zweiten Dimension, sowie eine Vielzahl von Waschmittel und Puffer-Systeme, ein vielseitiges System für die Suche und Charakterisierung von neuen Thylakoidmembran komplexe.
Abgesehen davon hatten native grün Gele ein Renommee für sein eine unzuverlässige Technik, vor allem in unerfahrenen Händen, da es einfach ist, bestehend aus fuzzy, schmierig Gele mit wenigen Bands zu schlechten Ergebnissen. Dieses Problem wurde gelöst, unter anderem mit der Einführung des blau-Native Seite19. Die Verwendung von Coommassie Farbstoff in der BN-Puffersystem macht Protein Trennung robuster. Daher, BN-Seite ist oft ein einfacher und zuverlässiger Technik für ein relativer Neuling einzurichten und bieten hochauflösende Trennungen der Thylakoidmembran komplexe. Aus diesen Gründen ist die BN-Seite die Methode der Wahl für die meisten Arbeiten dieses Feldes geworden. Während BN-Seite in der Regel langsamer ist zu laufen als grüne Gelelektrophorese sein Hauptnachteil ist, dass die Coommassie Farbstoff Färbung mischt sich mit der Identifizierung von schwachen Chlorophyll-haltigen Bands, während auch nachgeschaltete spektroskopische die Charakterisierung ist problematisch.
Die biochemische Informationen bereitgestellt durch native Gele und 2D SDS-PAGE kann erheblich gestärkt werden, wenn Sie mit Daten aus spektroskopischen Techniken kombiniert. Unabhängig von dem System beschäftigt, ist ein zentrales Problem bei der Verwendung von nativen Gele, um komplexe zu identifizieren, dass die Identifizierung immer angefochten werden kann (d. h. die Proteine in einer Band gefunden konnte immer dar comigrating Anlagen oder Komponenten, eher als einen einzigen physiologisch authentische Komplex). Spektroskopische Charakterisierung biophysikalische informiert über die Pigmente in grüne Gel-Bands und kann verwendet werden, um festzustellen, welche Arten von komplexen sie voraussichtlich enthalten sind. Chlorophyll-Fluoreszenz ist besonders hilfreich in dieser Hinsicht aufgrund der oft dramatisch unterschiedliche Spektren und Fluoreszenz-Lebensdauer, die charakteristisch für verschiedene photosynthetische Pigmente-Protein-komplexe. Während einfache stationäre 77K Fluoreszenz Spektren historisch bestätigt die Identität der native Gel komplexe nützlich gewesen, kann moderne Zeit korreliert einzelnes Photon counting (TCSPC) viel mehr Informationen liefern. TCSPC ermöglicht nicht nur die Charakterisierung der Fluoreszenz-Lebensdauer-komplexe, sondern ermöglicht auch die detaillierte Beschreibung der Energieübertragung zwischen den spektralen Komponenten innerhalb eines Komplexes. Diese Art von Charakterisierung wird zunehmend notwendig, da die Verwendung von verschiedenen einheimischen Gel Systeme breitet sich immer und neuen vermeintlichen komplexe entdeckt werden, die Identifizierung von Proteinkomplexen besser authentifiziert werden und neu biophysikalische Informationen darüber, wie diese komplexe arbeiten.
In diesem Papier stellen wir eine Methode, die diejenigen, die wenig oder keine Erfahrung mit native Gelelektrophorese qualitativ hochwertige Auflösung von nativen Thylakoidmembran komplexe zum Zwecke der Untersuchung der Mechanik der Licht Reaktionen erreicht ermöglicht Photosynthese. Diese Grundtechnik kann dann der Experimentator Ermessen Ergebnisse verbessern oder erweitern Anwendbarkeit auf andere Arten erweitert werden. Wir beschreiben den Prozess für native grüne Gel Bands TCSPC, sowie einige Schritte für die grundlegende Analyse und Darstellung der Daten zur Verfügung gestellt durch die Technik zu unterwerfen. Die Kopplung der gebürtige Gelelektrophorese mit TCSPC Analyse erstreckt sich das Dienstprogramm dieser Gel-Systeme durch Authentifizierung und biophysikalischen Charakterisierung der Proteinkomplexe innerhalb der Bänder. Das grüne Gel System hier beschriebenen basiert auf, die von Allen und Staehelin17 mit einigen Modifikationen entwickelt und ist identisch mit dem in Schwarz Et al.verwendet. 20. dieses System ist eine von vielen aber hat spezifische Eigenschaften, die nützlich für diese Methode sind. Es ist schnell genug, so dass Thylakoidmembran Isolation, Gelelektrophorese und TCSPC Analyse bequem an einem Tag erfolgen können, mögliche Probleme der Probe Lagerung und Abbau vermieden. Wir finden auch, dass diese Methode in die Hände von unerfahrenen Benutzern, robust und trotzdem einen Ergebnisse, die von Vorgesetzten, je nach dem Grad der Optimierung gut reichen.
Es ist wichtig zu bedenken, die die komplexe visualisiert auf eine native Gel abhängen auf das Waschmittel und Puffer Systemen verwendet, sowie über die Biologie des Organismus untersucht. Verschiedene Reinigungsmittel und Puffer-Systeme bevorzugt verschiedene Arten von komplexen trennen und haben ein bestimmter photosynthetische Organismus verschiedene komplexen von anderen Organismen, von denen nicht, die alle angegebenen keinesfalls anwesend sein wird. Das hier beschriebene System eignet sich besonders für die Untersuchung von PSI Megacomplexes, wie in Schwarz Et al.beschrieben. 20, aber es fällt auf mehr destabilisierenden Ende des Spektrums für Studierende PSII Megacomplexes. Für eine umfassende Studie über die verschiedenen Reinigungsmittel und Puffer-Systeme in der gebürtige Gelelektrophorese der Thylakoidmembran Proteine verwendet empfiehlt es sich, Järvi Et al.zu überprüfen. 21 und Rantala Et al. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

Die Licht-Reaktionen der Photosynthese werden durch eine Reihe von pigmentierten Proteinkomplexe in die Thylakoidmembran Membranen durchgeführt. Die Stöchiometrie und Organisation dieser komplexe ist sehr dynamisch an langen und kurzen Zeitskalen durch Prozesse, die Photosynthese an sich verändernde Umweltbedingungen anpassen (d.h. nicht-photochemische abschrecken, Statusübergänge, und die langfristige Antwort). In der Vergangenheit diese Prozesse haben spektroskopisch im Hinblick auf Veränderungen im Chlorophyllfluoreszenz beschrieben, und Spektroskopie bleibt eine wichtige Methode zur Überwachung der photosynthetischen Parameter. Es gibt eine begrenzte Anzahl von Möglichkeiten, in denen die zugrunde liegenden komplexen Proteindynamik visualisiert werden können. Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode für die hochauflösende Trennung und Visualisierung der Thylakoidmembran komplexe, native grüne Gelelektrophorese. Diese Methode ist gekoppelt mit Zeit korreliert einzelnes Photon counting für detaillierte Charakterisierung der Chlorophyll-Fluoreszenzeigenschaften von Bands, die auf das grüne Gel getrennt.

Repräsentative Ergebnisse für grüne Gelelektrophorese sind in Abbildung 1dargestellt. Bahn 1 enthält ein Beispiel für optimale Ergebnisse für grüne Gelelektrophorese von Spinat Thylakoids, in denen eine maximale Anzahl an klare, gestochen scharfe grüne Bänder sichtbar sind. Diese Ergebnisse sind teilweise etwas untypisch, weil nicht alle Bands gesehen in Spur 1 normalerweise in einer Probe vorhanden sind. Zusätzliche Probe Bereinigung, in Form von C...

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur solubilisiert Thylakoidmembran komplexe durch Native grün Gelelektrophorese getrennt. Grüne Gel Bänder zeichnen sich danach durch Zeit korreliert Single Photon Counting (TCSPC) und grundlegenden Schritte für die Datenanalyse werden zur Verfügung gestellt.

Trennung von Spinat Thylakoidmembran Proteinkomplexe durch Native grün Gelelektrophorese und Band Charakterisierung mittels Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Diese Methode ist nützlich, um bestimmte Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Photosyntheseforschung zu beantworten, wie z. B. vermeintliche Thylakoidkomplexe physiologisch reale Komplexe mit energetisch verbundenen Komponenten? Der Hauptvorteil des hier beschriebenen grünen Gels und TCSPC-Protokolls ist, dass es schnell und robust ist. Proben können einfach an einem einzigen Tag verarbeitet und analysiert werden, was Probleme der Lagerung und Stabilität weniger bedenklich macht.Obwohl TCSPC Einblicke in die photosynthetischen Systeme geben kann, die wir hier untersucht haben, kann es auch auf andere Systeme angewendet werden, die von chemischen bis hin zu physikalischen Systemen reichen, wie z. B. Studien zur fluoreszierenden molekularen Bewegung in Flüssigkeiten, Zellen oder neuartigen strukturellen Motiven wie monomolekularen Schichten und ionischen Flüssigkeiten. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die benötigten Bestandslösungen und grünen Minigele vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes, erhalten Sie etwas Eis und dim die Lichter.Mit einem Glas-Dounce-Homogenisator die Spinatblätter in etwa ein bis zwei Milliliter TMK-Puffer vollständig homogenisieren. Um ein einfaches Filtergerät zu erstellen, schneiden Sie eine empfindliche Aufgabe in die Hälfte wischen und falten Sie es in Viertel. Entfernen Sie den Kolben von einer Spritze, und packen Sie dann die gefaltete Aufgabe in den Boden der Spritze wischen.Pipette das Blatt homogenatin in die Mitte des Task-Wisch-Filters, dann verwenden Sie den Kolben, um das Homogenat durch den Filter zu passieren und sammeln Sie es in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 5.000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, um das unlösliche Material, einschließlich der Thylakoidmembranen, zu pellet. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter TMK-Puffer wieder auf.Um Chlorophyll aus jeder Probe zu extrahieren, nehmen Sie einen 50-Mikroliter-Aliquot und geben Sie es in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 950 Mikroliter Methanol hinzu, verkappen Sie das Rohr und mischen Sie es, indem Sie es mehrmals invertieren. Zentrifugieren Sie bei 10.000 g für 10 Minuten, um die gefällten Proteine zu pellet.Mit den Chlorophyll-Konzentrationsmessungen als Leitfaden, entfernen und entsorgen Sie einige Volumen aus jeder Probe bei Bedarf, bis jedes Rohr die gleiche Gesamtmenge an Chlorophyll enthält. Zentrifuge bei 5.000 g für 10 Minuten, um die Thylakoid-Membranen neu zu pellet. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, wobei Sie darauf achten, den gesamten Überstand zu entfernen, ohne das Pellet zu stören.Zuerst tauen Sie eine Aliquot von TMK 30%Glycerin-Waschmittellösung auf. Mehrmals inumtieren, um die Lösung zu mischen und auf Eis zu halten. Fügen Sie ein geeignetes Volumen der Waschmittellösung hinzu, um das Pellet aufzulösen und zu einer endgültigen Chlorophyllkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu führen.Pipette immer wieder nach oben und unten, während Sie darauf achten, Schaum in der Probe zu vermeiden. Dann halten Sie die Probe auf Eis, damit Thylakoidproben löslich sind. Nach Abschluss der Löslichkeit zentrieren Sie die Probe bei 10 000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, um das unlösliche Material zu pellet, was zu einem klaren, dunkelgrünen Überstand führt.Danach 15 Mikroliter gelöster Thylakoid-Überstand direkt auf jeden Brunnen eines zuvor hergestellten 1,5-Millimeter-Native-Gels laden. Verwenden Sie den 1X-Laufpuffer, beginnen Sie mit der Ausführung des nativen grünen Gels bei 100 Volt. Legen Sie den gesamten Geltank für die Dauer des Laufs auf nasses Eis, um die widerstandsbeständige Erwärmung zu mildern.Wenn das Gel fertig ist, entfernen Sie es aus der Elektrophoresezelle und spülen Sie den Laufpuffer der Gelplatten mit destilliertem Wasser ab. Entfernen Sie die obere Platte aus dem Gel und spülen Sie das Gel dann mit destilliertem Wasser ab. Legen Sie das Gel, das sich noch auf der unteren Glasplatte befindet, auf Eis; wenn das Gel nicht in Gebrauch ist, bedecken Sie es mit Plastikfolie und halten Sie es im Dunkeln, um zu verhindern, dass es austrocknet.Als Nächstes verwenden Sie ein scharfes Skalpell oder rasiermesser, um jedes Band von Interesse zu verbrauchen, wenn sie bereit sind, mit der TCSPC-Analyse fortzufahren. Stellen Sie sicher, dass das ausgeschnittene Band kein kontaminierendes Bandmaterial enthält. Verwenden Sie für jeden zu analysierenden Komplex ein fluoreszierendes Spektrometer, um ein Raumtemperatur-Fluoreszenzspektrum zwischen 600 und 800 Nanometern zu erstellen.Legen Sie Klebeband an beiden Enden der Dias und falten Sie es mehrmals, um Abstandshalter zu erstellen, sodass die Dias fest zusammengehalten werden können, ohne den Raum dazwischen zu komprimieren, und dann die Gelscheibe zwischen zwei Glasmikroskopie-Dias einstecken kann. Fügen Sie der Gelscheibe am Rand der Glasgleiter naden Sie eine kleine Menge Wasser hinzu, um eine glatte Schnittstelle zu schaffen, die die Signalstreuung reduziert. Als nächstes klemmen Sie das Gel-Sandwich in den Balkenweg, so dass der Strahl die Gelscheibe durch den offenen Rand der Platten trifft.Sammeln Sie für jeden Komplex in regelmäßigen Abständen 10 000 Gesamtdatenpunkte im gesamten Fluoreszenzemissionsspektrum. Um die Daten für einen bestimmten Komplex zu analysieren, normalisieren Sie zunächst die Spitzenhöhe jeder Zerfallskurve für alle gesammelten Wellenlängen, und passen dann die Schwanzkurve dem stationären Fluoreszenzspektrum des Komplexes an, wie im Textprotokoll beschrieben. Repräsentative Ergebnisse für die grüne Gelelektrophorese sind ein Beispiel für ein ideales Ergebnis für die Analyse von Spinatthylakoiden, bei denen eine Reihe klarer, scharfer grüner Bänder sichtbar sind.Die Bahnen 2 und 3 zeigen typischere Ergebnisse der einfachen Thylakoid-Isolierung und Elektrophorese auf einem nicht-gradienten 5%acrylamid-Gel. Die Bahnen 4, 5 und 6 sind ein Beispiel für schlechte Ergebnisse aufgrund der zunehmenden Unterlöslichkeit der Thylakoidprobe, während Spur 7 die Ergebnisse demonstriert, die erzielt werden können, wenn Arabidopsis Thylakoide anstelle von Spinat verwendet werden. Nachdem die Datenkurven der TCSPC-Daten auf das gleiche Zeitregister eingestellt wurden, können sie auf die gleiche Spitzenhöhe normalisiert werden, wodurch die Kurven als erste Analyse der Daten verglichen werden können.Peak-normalisierte Zerfallskurven aus verschiedenen Komplexen können dann bei einer bestimmten Wellenlänge miteinander überlagert werden, so dass die Verhaltensunterschiede zwischen den Komplexen visualisiert werden können. Der Schwanz, der den Zerfallskurven entspricht, ermöglicht die Konstruktion von zerfallsassoziierten Spektren. Wie hier zu sehen, ist das zerfallsassoziierte Spektren für den LHCII durch den Mangel an dynamischen Merkmalen bemerkenswert und die Form des LHCII-Fluoreszenzspektrums bleibt die gleiche wie das Signal zerfällt im Laufe der Zeit.Der Zerfall des Fluoreszenzspektrums verzögert sich ebenfalls, was 100 Pikosekunden erfordert, um eine maximale Fluoreszenz zu erreichen. Dies deutet darauf hin, dass Energie nicht zwischen energetisch unterschiedlichen Pigmenten innerhalb des Komplexes übertragen wird, wenn die Fluoreszenz zerfällt. Die zerfallsassoziierten Spektren werden dann für den Band 5-Komplex konstruiert.Im Vergleich zum LHCII zerfällt die Fluoreszenz von Band 5 viel schneller und erreicht die maximale Intensität in nur 30 Pikosekunden und verfällt dann nach 500 Pikosekunden auf weniger als 20% der Anfangsintensität. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Interpretation der TCSPC-Daten auf zusätzlichen biochemischen Informationen beruhen wird, die die Komponenten der untersuchten Komplexe identifizieren, z. B. durch 2 DSDS-PAGE und Western Blotting oder Massenspektrometrie.

Research

JoVE Journal

Environment

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Forschung

Umwelt

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