Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

מימון ותמיכה נמסרו בידי במחלקה לכימיה באוניברסיטת מישיגן.

1. מלאי פתרונות הכנה למזיגה יליד ג'ל ירוק
<ol><li>הכן של 4x בופר מרוכזים לפתרון ג'לים בהיקף של 40% גליצרול, 200 מ"מ גליצין ו- 100 מ מ טריס buffered ל pH 8.3.</li>
	<li>היכונו של 4x בופר מרוכז ג'לים הערימה בהיקף של 40% גליצרול, 200 מ"מ גליצין ו- 100 מ מ טריס buffered ל pH 6.3.</li>
	<li>חנות מאגרים אלה ב 4 ° C כדי למנוע הצמיחה של עובש. הע?...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

תילקואיד מוצלח solubilization עם ג'ל יליד לרוץ יביא את הרזולוציה של מספר להקות ירוק ברורים לעין על הג'ל ללא עיוותים משמעותיים או מריחת הלהקות. העמסת את הג'ל, ריכוז גבוה דטרגנט, pH שגוי הדגימה, undissolved חומר, פועל הג'ל מהר מדי או בטמפרטורה גבוהה מדי, ג'ל יציקת באופן לא תקין הם גורמים שעשויים לתרום מתחמי ת?...

אורגניזמים פוטוסינתטיים עליך כל הזמן להתאים את הפיזיולוגיה שלהם לשינוי תנאי הסביבה על מנת למקסם את התפוקה שלהם להתמודד בהצלחה עם השכנים1. הדבר נכון במיוחד של מכונות אחראי לתגובות אור פוטוסינתזה, כמו תאורת תנאים יכול להשתנות על ידי שלושה סדרי גודל בין צללים ואור שמש מלאה. בנוסף, גורמים סביבתיים כגון: יובש, קור, או עומס חום יכול להפחית את הזמינות של פחמן דו-חמצני עבור קיבוע פחמן, אשר לכיור אלקטרון טבעי עבור המוצרים של תגובות אור. צמחים עליך, לכן, הקציר, לנצל את קרינת השמש בצורה היעילה ביותר האפשרית תוך שמירה על היכולת להפיג את אנרגיית האור עודף לפי הצורך. עדיין, photooxidative נזק מתרחש באופן שגרתי תחת כל תנאי אור2,3, כשל לנהל נספג עירור אנרגיה בהצלחה יכול לגרום נזק לתאים קטסטרופלי, מוות. מספר מנגנונים גמישים קיימים המאפשרים את המנגנון פוטוסינתטיים ויתכן וייקלטו שינויים בתנאים הסביבתיים השוררים וגם תנודות זמניות (קרי, על פני צירי זמן ארוך וקצר)4. אלה כוללים את התגובה לטווח ארוך (משמאל לימין) ללא פוטו אטמוספרי שכבתה (NPQ). NPQ הוא עצמו נחשב להקיף לפחות שלושה תופעה רכיב, כולל מעברים למצב (qT), אנרגיה במהירות inducible שכבתה (qE) של קרינה (qI)5.
תהליכים אלה היו במקור נצפתה ומוגדר במידה רבה מבחינת תופעות ספקטרוסקופיות [למשל, NPQ מתייחס ירידה בזריחה שנצפה כלורופיל (שכבתה של כלורופיל זריחה) שאינו בשל עלייה בשיעור של פוטוכימיה]6. המונח "מעברים למצב" באופן דומה מתייחס לשינוי נצפתה כמות יחסית של קרינה פלואורסצנטית PSI, PSII7. בזמן הטכניקות ספקטרוסקופיות שהפכו ספירה של תופעות אלו אפשרי [בפרט, הדופק משרעת מאופנן (פאם) זריחה ספקטרוסקופיה] ולהמשיך להיות אמצעי חיוני להתבוננות לנתח תהליכים פוטוסינתטיים ב ויוו, במידה רבה של ביוכימיה נדרש כדי להבהיר את המנגנונים האלה תצפיות ספקטרוסקופיות. מעברים המדינה, למשל, כרוך מחזור זרחון/dephosphorylation של החלבונים LHCII על ידי STN7 קינאז ו TAP38/PPH1 פוספטאז, בהתאמה8,9,10. מחזור זה מכוונן את התפלגות הפיזי של האנטנה LHCII בין photosystems שני על-ידי העברת חלק LHCII trimers מן PSII PSI, וכך לשנות את הספיגה חתך של11,photosystems12. הרכיב qE של NPQ ממיר במהירות עירור עודף אנרגיה חום באמצעות הפעולות של מחזור epoxidation/דה-epoxidation violaxanthin/וזאקסנטין ואת החלבון PsbS. התפקיד המדויק של PsbS בתהליך זה הוא עדיין לא מובן במלואו13. הרכיב הצ'י של NPQ, קרינה, בדרך כלל המיוחס נזק החלבון D1 של PSII. שיקום הסמכות פוטוסינתטיים מלא דורש תהליך תיקון משוכללת כדי לתקן את photocenters PSII פגום. מחזור תיקון PSII כרוך ההעברה של מתחמי PSII ערימות granal, פירוק מתחמי, החלפה של חלבונים פגומים D1, ההרכבה מחדש של מתחמי PSII, ותנועה של מתחמי PSII בחזרה לתוך ערימות granal14. טבעו המדוייק של קרינה, נזקי PSII נותרת כנושא של בדיקה אינטנסיבית15.
הקושי בלימוד תופעות כמו מצב המעברים או תיקון PSII בחלקה נובעת העובדה שזה לא דרך פשוטה אחת כדי להמחיש את המכניקה של מערכות מורכבות הביוכימי. הגישה הביוכימי הקלאסי להבנת תהליך היא להפריד בין מרכיביו קודם כך הם יכולים להתאפיין בבידוד. אלקטרופורזה בג'ל יליד עלתה מן מאמצי מוצלח בשנות השמונים כדי להפריד ולאפיין את מתחמי photosystem של הממברנות תילקואיד עם מפוח שיטות (כלומר צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז ו כרומטוגרפיה) עוד16. המערכות דטרגנט שפותחו כדי solubilize בעדינות את מתחמי מקורית של הממברנות תילקואיד הוסבו בקרוב כדי שיטות הפרדה electrophoretic, בייחוד על ידי אלן ו- Staehelin17 , פיטר, Thornber18, וקורים ירוק יליד ג'ל אלקטרופורזה. בעוד המייצג רק אחד מתוך מגוון רחב של טכניקות בארסנל ניסיוני, יליד דף יש מספר מאפיינים אטרקטיביים שהפכו אותו שיטה נרחב מועסקים במחקר פוטוסינתזה. דף מקורי הוא יחסית מהיר ופשוט, הדורשים ציוד קצת מיוחד, תוך מתן ההפרדה ברזולוציה גבוהה של מספר רב של מתחמי תילקואיד בו זמנית. זה הופך דף יליד כלי נוח ללמוד תילקואיד dynamics, בשילוב עם דף רגיל ב הממד השני, כמו גם מגוון רחב של חומרי ניקוי ומערכות מאגר, מערכת רב תכליתי עבור איתור ואפיון מתחמי תילקואיד חדש.
זה נאמר, יליד ג'ל ירוק היה מוניטין של היותו טכניקה לא אמין, במיוחד בידיים לא מנוסים, כפי קל לייצר תוצאות המסכן המורכב ג'לים פרוותי, smeary עם כמה להקות. פתרו את הבעיה, בין השאר, עם כניסתה של כחול-יליד עמוד19. השימוש coommassie צבע במערכת מאגר בסון עושה את ההפרדה חלבון עמידים יותר. לכן, בסון-דף הוא לרוב טכניקה קלה ומהימנה יותר עבור טירון יחסית להגדיר, יכול לספק הפרדות צבע ברזולוציה גבוהה של מתחמי תילקואיד. מסיבות אלו, בסון-דף הפכה לשיטת הבחירה למרבית העבודות של שדה זה. בעוד בסון-דף הוא בדרך כלל איטי יותר להפעיל יותר בג'ל ירוק, החיסרון העיקרי שלה זה ההכתמה לצבוע coommassie מפריע הזיהוי של להקות המכילים כלורופיל חלש, תוך גם במורד הזרם ספקטרוסקופיות אפיון בעייתי.
המידע הביוכימי ג'לים יליד ואולם מרחביות 2D-דף יכול להיות חיזקה אצלי מאד בשילוב עם נתונים משיטות ספקטרוסקופיות. בלי קשר המערכת המועסקים, הוא בעיה מרכזית עם באמצעות ג'ל יליד לזיהוי מתחמי כי הזיהוי ניתן תמיד לערער (קרי, החלבונים נמצא בלהקה יכול תמיד לייצג קומפלקסים comigrating או רכיבים, אלא מאשר יחיד אותנטי מבחינה פיזיולוגית קומפלקס). אפיון ספקטרוסקופיות מספק מידע ביופיזיקלי על הפיגמנטים בלהקות ג'ל ירוק והוא יכול לשמש כדי לקבוע אילו סוגים של מתחמי הם נוטים להכיל. כלורופיל הוא שימושי במיוחד בהקשר זה בשל ספקטרום שונה לעיתים קרובות באופן דרמטי ואורך פלורסצנטיות האופייניים של מכלולים שונים פוטוסינתטיים פיגמנט-חלבון. בזמן מצב יציב פשוטה 77K פלורסצנטיות ספקטרה מבחינה היסטורית היו שימושיים המאשרת את הזהויות של מתחמי ג'ל מקורית, מודרני בקורלציה זמן יחיד פוטון לספור (TCSPC) יכול לספק מידע רב יותר. TCSPC מאפשר לא רק אפיון מתחמי מבוסס על קרינה פלואורסצנטית גלגולי חיים, אך גם מאפשר את תיאור מפורט של העברת אנרגיה בין רכיבי ספקטרלי בתוך מתחם. סוג זה של אפיון הופך להיות הכרחי יותר ויותר כמו השימוש של ממרחים שונים של מערכות ג'ל מקורית, מתחמי בשם חדשים מתגלים, המאפשר הזיהוי של חלבון מתחמי כדאי לבצע אימות, מתן חדש מידע ביופיזיקלי על איך אלה מתחמי העבודה.
נייר זה, אנו מספקים שיטה המאפשרת את אלה שיש להם מעט או ללא ניסיון עם יליד אלקטרופורזה בג'ל כדי להשיג רזולוציה באיכות גבוהה של מתחמי תילקואיד יליד במטרה לחקור את המכניקה של התגובות אור של פוטוסינתזה. לאחר מכן ניתן בתוספת טכניקה בסיסית זו על פי שיקול דעתה של הנסיין לשפר תוצאות או להרחיב את תחולת למינים אחרים. לאחר מכן נתאר את התהליך עבור העמדת להקות ג'ל ירוק יליד TCSPC, כמו גם כמה צעדים עבור ניתוח בסיסי והצגת הנתונים שנמסרו על ידי הטכניקה. המושבים של בג'ל מקורית עם ניתוח TCSPC מרחיב את התועלת של מערכות אלה ג'ל על-ידי אספקת אימות ואפיון ביופיזיקלי של חלבון מתחמי בתוך הלהקות. מערכת ג'ל ירוק המתוארים כאן מבוסס על שפותחה על ידי אלן ו- Staehelin17 עם מספר שינויים, זהה בשימוש שוורץ ואח. 20. מערכת זו היא אחת מני רבות אבל יש תכונות ספציפיות שימושיות על מתודולוגיה זו. זה מספיק מהירה כך תילקואיד בידוד, בג'ל, וניתוח TCSPC נוח יכול להתבצע ביום אחד, obviating בעיות פוטנציאליות של אחסון מדגם והשפלה. אנחנו גם מוצאים כי שיטה זו היא חזקה בידיים של משתמשים לא מנוסים, תוך כדי מתן תוצאות שנעים בטווח שבין טוב הממונה, ובהתאם למידת אופטימיזציה.
חשוב לזכור כי מתחמי דמיינו על ג'ל יליד תלויים במערכות דטרגנט וגם מאגר בשימוש, כמו גם על הביולוגיה של האורגניזם תחת חקירה. חומרי ניקוי שונים ומערכות מאגר מעדיפים להפריד בין סוגים שונים של מתחמי, אורגניזם פוטוסינתטיים נתון יהיו מתחמים שונים של אורגניזמים אחרים, לא כולן להיות נוכחים בכל נסיבות נתון. מערכת המתוארים כאן מתאימה בעיקר במחקר של PSI megacomplexes, כפי שמתואר שוורץ ואח. 20, אבל זה נופל על קצה הספקטרום יותר חמוד על הלומדים PSII megacomplexes. עבור מחקר מקיף של דטרגנט ומאגר המערכות השונות בשימוש בג'ל מקורית של חלבונים תילקואיד, מומלץ לסקור ירווי ואח. 21 ו- Rantala. et al. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

התגובות אור של הפוטוסינתזה מתבצעות על ידי סדרה של חלבון פיגמנט מתחמי תילקואיד בקרום. סטויכיומטריה וארגון של מתחמי אלה הוא דינמי מאוד ארוך והן פרקי זמן קצרים עקב תהליכים להתאים פוטוסינתזה לתנאי הסביבה המשתנים (קרי, ללא פוטו אטמוספרי שכבתה, מעברים למצב, ו תגובה לטווח ארוך). מבחינה היסטורית, תהליכים אלה תוארו spectroscopically מבחינת שינויים בכלורופיל פלורסצנטיות, ונותרה ספקטרוסקופיה שיטה חיונית עבור ניטור פרמטרים פוטוסינתטיים. יש מספר מוגבל של דרכים שבהן ניתן לאבחן את הדינמיקה מורכבת חלבון המשמש כבסיס. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה ההפרדה ברזולוציה גבוהה והדמיה של מתחמי תילקואיד, יליד ירוק אלקטרופורזה בג'ל. שיטה זו היא יחד עם הזמן בקורלציה פוטון יחיד סופר על אפיון מפורט של המאפיינים פלורסצנטיות כלורופיל של להקות מופרדים על הג'ל ירוק.

נציג תוצאות אלקטרופורזה בג'ל ירוק מוצגים באיור1. ליין 1 מספק דוגמה של תוצאות אידיאלי עבור בג'ל הירוק של thylakoids תרד, שבו מספר מרבי של להקות ירוק ברורה, חדה גלויים. תוצאות אלה הן במידה מסוימת לא טיפוסיות, בין השאר כי לא כל הלהקות ראיתי ליין 1 הם בדרך כלל הנוכח במד...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להפריד בין מתחמי תילקואיד solubilized על ידי הילידים בג'ל ירוק. להקות ג'ל ירוק לאחר מכן מאופיינים על ידי הזמן בקורלציה יחיד פוטון לספור (TCSPC) ומסופקים שלבים בסיסיים לניתוח נתונים.

ההפרדה של תרד תילקואיד חלבון מתחמי מאת מקורית ירוק בג'ל ואפיון הלהקה באמצעות Time-Correlated סופר פוטון יחיד

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

שיטה זו שימושית למענה על שאלות מפתח מסוימות בתחום מחקר הפוטוסינתזה כגון קומפלקסים תילקואידיים פיזיולוגיים אמיתיים עם רכיבים המחוברים אנרגטית? היתרון העיקרי של הג'ל הירוק ופרוטוקול TCSPC המתוארים כאן הוא שהוא מהיר וחזק. ניתן לעבד ולנתח דגימות בקלות ביום אחד, מה שהופך את בעיות האחסון והיציבות לפחות מדאיגות.למרות TCSPC יכול לספק תובנה לתוך מערכות פוטוסינתטיות שלמדנו כאן, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות החל כימי דרך פיזית וביולוגית כגון מחקרים של תנועה מולקולרית פלואורסצנטית בנוזלים, תאים, או מוטיבים חדשניים מבניים כגון שכבות monomolecular ונוזלים יוניים. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את פתרונות המלאי הדרושים ואת מיני ג'לים ירוקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להשיג קצת קרח לעמעם את האורות.באמצעות homogenizer Dounce זכוכית, הומוגניזציה לחלוטין את עלי תרד בערך אחד עד שני מיליליטר של חיץ TMK. כדי ליצור התקן סינון פשוט, גזור מחיקת משימה עדינה לשניים וקפל אותה לרבעים. הסר את הבוכנה ממזרק, ולאחר מכן לארוז את המשימה מקופלת לנגב לתוך החלק התחתון של המזרק.פיפטה הומוגנט עלה למרכז מסנן לנגב את המשימה, ולאחר מכן להשתמש בוכנה כדי להעביר את homogenate דרך המסנן ולאסוף אותו בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הומוגנית ב 5, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה את החומר מסיס, כולל קרום thylakoid. השלך את העל-טבעי וזרוק מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של מאגר TMK.כדי לחלץ כלורופיל מכל דגימה, יש ליטול אליקוט 50 מיקרוליטר ולהעבירו לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מוסיפים 950 מיקרוליטרים של מתנול, מכסים את הצינור ומערבבים על ידי היפוךו מספר פעמים. צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך 10 דקות כדי גלולה חלבונים זירז.באמצעות מדידות ריכוז כלורופיל כמדריך, להסיר ולהשליך קצת נפח מכל מדגם לפי הצורך עד כל צינור מכיל את אותה כמות כוללת של כלורופיל. צנטריפוגה ב 5, 000 גרם במשך 10 דקות כדי להפוך מחדש את קרום thylakoid. הסר והשליך את העל-טבעי, הקפד להסיר את כל העל-טבעי מבלי להפריע לכדור.ראשית, להפשיר aliquot של TMK 30% פתרון דטרגנט גליצרול. הפוך מספר פעמים כדי לערבב ולשמור את הפתרון על קרח. הוסף נפח מתאים של פתרון חומר הניקוי כדי להמיס את גלולה וכתוצאה מכך ריכוז כלורופיל סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.פיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב תוך הקפדה להימנע קצף בדגימה. לאחר מכן, לשמור את הדגימה על הקרח כדי לאפשר דגימות thylakoid להתבודד. לאחר השלמת המסיסה, צנטריפוגה המדגם ב 10, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה החומר מסיס, וכתוצאה מכך ברור, ירוק כהה על טבעי.לאחר מכן, לטעון 15 microliters של עלנט נטנט תילקואיד מנוזל ישירות על כל באר של ג'ל מקומי מוכן בעבר 1.5 מילימטר. באמצעות חיץ ריצה 1X, להתחיל להפעיל את הג'ל הירוק המקורי ב 100 וולט. מניחים את מיכל הג'ל כולו על קרח רטוב למשך הריצה כדי למתן חימום התנגדותי.כאשר הג'ל סיים לרוץ, הסר אותו מתא האלקטרופורזה ושטוף את המאגר הזורם מצלחות הג'ל במים מזוקקים. מוציאים את הצלחת העליונה מהג'ל ואז שוטפים את הג'ל במים מזוקקים. מניחים את הג'ל, שעדיין נמצא על צלחת הזכוכית התחתונה, על קרח;כאשר הג'ל אינו בשימוש, מכסים אותו בניילון נצמד ולשמור אותו בחושך כדי למנוע ממנו להתייבש.לאחר מכן, השתמש אזמל חד או סכין גילוח כדי excise כל רצועה של עניין כאשר מוכן להמשיך עם ניתוח TCSPC. ודא כי הלהקה excised אינו מכיל חומר רצועה מזהם. עבור כל קומפלקס להיות מנותח, להשתמש ספקטרומטר פלואורסצנטי כדי להפוך ספקטרום פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר בין 600 ל 800 ננומטר.מניחים סרט מיסוך על כל קצה של השקופיות ומקפלים אותו על פני כמה פעמים כדי ליצור רווחים, אשר יאפשר את המחוונים להיות מוחזקים יחד בחוזקה מבלי לדחוס את הרווח בין, ולאחר מכן כריך את פרוסת הג'ל בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. מוסיפים כמות קטנה של מים לפרוסת הג'ל בקצה מגלשות הזכוכית כדי ליצור ממשק חלק שיפחית את פיזור האותות. לאחר מכן, מהדקים את כריך הג'ל בנתיב הקרן כך שהקרן פוגעת בפרוסת הג'ל דרך הקצה הפתוח של הצלחות.עבור כל קומפלקס, לאסוף 10,000 נקודות נתונים הכולל במרווחי זמן קבועים על פני ספקטרום פליטת הפלואורסצנטיות. כדי לנתח את הנתונים עבור קומפלקס נתון, תחילה לנרמל את גובה השיא של כל עקומת ריקבון עבור כל אורכי הגל שנאספו, ולאחר מכן זנב להתאים כל עקומת ריקבון לספקטרום פלואורסצנטי מצב יציב של המורכבות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. תוצאות מייצגות עבור אלקטרופורזה ג'ל ירוק מספק דוגמה של תוצאה אידיאלית לניתוח של thylakoids תרד, שבו מספר ברור, להקות ירוקות חדות גלויים.נתיבים 2 ו-3 מציגים תוצאות אופייניות יותר מבידוד תילאקואידי פשוט ואלקטרופורזה על ג'ל אקרילמיד שאינו שיפוע 5%. נתיבים 4, 5 ו-6 מספקים דוגמה לתוצאות גרועות עקב הגדלה של דרגות של מסיסות תחת מסיסות של דגימת התילקואידים, בעוד נתיב 7 מדגים את התוצאות שניתן להשיג כאשר נעשה שימוש בבילאקואידים של Arabidopsis במקום תרד. לאחר עקומות הנתונים של נתוני TCSPC נקבעו לאותה קופת זמן, ניתן לנרמל אותם לאותו גובה שיא, המאפשר להשוות את העקומות כניתוח ראשון של הנתונים.עקומות ריקבון מנורמלות שיא ממתחמים שונים ניתן לאחר מכן להיות מכוסה אחד עם השני באורך גל נתון, המאפשר את ההבדלים בהתנהגות בין המתחמים להיות חזותיים. זנב התואם את עקומות הריקבון מאפשר בניית ספקטרום הקשור לריקבון. כפי שניתן לראות כאן, הספקטרום הקשור לריקבון עבור LHCII בולט בהיעדר תכונות דינמיות וצורת ספקטרום הפלואורסצנטיות LHCII נשארת זהה לאות נרקב לאורך זמן.הריקבון של ספקטרום הפלואורסצנטיות מתעכב גם הוא, ודורש 100 פיקוז-שניות כדי להגיע לפיואורסצנטיות מקסימלית. הדבר מצביע על כך שהאנרגיה אינה מועברת בין פיגמנטים מובחנים אנרגטית בתוך המתחם כאשר הפלואורסצנטיות נרקבת. הספקטרום הקשור לריקבון נבנה לאחר מכן עבור מתחם הלהקה 5.בהשוואה ל- LHCII, הפלואורסצנטיות של Band 5 נרקבת הרבה יותר מהר, ומגיעה לעוצמה מקסימלית רק ב -30 פיקוסקנדים ולאחר מכן נרקבת לפחות מ -20% מהעוצמה הראשונית לאחר 500 פיקוסקנדים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי פרשנות של נתוני TCSPC יסתמך על מידע ביוכימי נוסף המזהה את מרכיבי המתחמים תחת מחקר, למשל, על ידי 2 DSDS-PAGE ו- Blotting מערבי או ספקטרומטריית מסה.

Research

JoVE Journal

Environment

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

אפיון ויישום של דוגמים פסיביים עבור ניטור של דברה במים

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

הפקת ואפיון של חומרים פעילי שטח מ אירוסולים באטמוספירה

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

מדידה ומיפוי דפוסים של סחף אדמה ומשקעים הקשורים אדמה ריכוזים קרבונט תחת ניהול חקלאיים

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של DNA פטרייתי

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

לכימות הצמח חלבון מסיס והתוכן לעיכול פחמימות, באמצעות תירס (זיה מייז) כמו שיוצרו

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

זיהוי של אמנון אגם וירוס באמצעות קונבנציונאלי RT-PCR ו SYBR ירוק RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...