Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
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मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय में रसायन विज्ञान विभाग द्वारा अनुदान और सहायता प्रदान की गई ।

1. स्टॉक समाधान देशी ग्रीन जैल डालने के लिए तैयारी
<ol><li>४०% ग्लिसरॉल, २०० mm glycine, और १०० mm Tris पीएच ८.३ के लिए बफर शामिल जैल हल करने के लिए एक 4x केंद्रित बफर समाधान तैयार करें ।</li>
	<li>४०% ग्लिसरॉल, २०० mm glycine, और १०० mm Tris पी?...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

एक सफल thylakoid solubilization और देशी जेल रन महत्वपूर्ण विरूपण या बैंड के धब्बा के बिना जेल पर कई अलग दिखाई हरी बैंड के संकल्प में परिणाम होगा । जेल, एक उच्च डिटर्जेंट एकाग्रता, एक गलत नमूना पीएच, undissolved सामग्री, जेल भी त?...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

प्रकाश संश्लेषण की हल्की प्रतिक्रियाओं thylakoid झिल्ली में pigmented प्रोटीन परिसरों की एक श्रृंखला द्वारा किए जाते हैं । stoichiometry और इन परिसरों के संगठन दोनों लंबे और छोटे समय प्रक्रियाओं है कि पर्यावरण की स्थिति बदलने के लिए प्रकाश संश्लेषण के कारण तराजू पर अत्यधिक गतिशील है (यानी, गैर photochemical शमन, राज्य संक्रमण, और दीर्घकालिक प्रतिक्रिया) । ऐतिहासिक रूप से, इन प्रक्रियाओं को क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के संदर्भ में spectroscopically बताया गया है, और स्पेक्ट्रोस्कोपी संश्लेषक मापदंडों की निगरानी के लिए एक महत्वपूर्ण विधि बनी हुई है. वहां तरीकों की एक सीमित संख्या में अंतर्निहित प्रोटीन जटिल गतिशीलता visualized किया जा सकता है । यहां हम उच्च संकल्प जुदाई और thylakoid परिसरों, देशी ग्रीन जेल ट्रो के दृश्य के लिए एक तेज और सरल विधि का वर्णन । इस विधि समय के साथ युग्मित-हरी जेल पर अलग बैंड के क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति गुणों के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए एक फोटॉन गिनती संबद्ध है ।

ग्रीन जेल ट्रो के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1में प्रस्तुत कर रहे हैं । लेन 1 पालक thylakoids के ग्रीन जेल ट्रो के लिए आदर्श परिणाम का एक उदाहरण प्रदान करता है, जिसमें स्पष्ट, तेज हरी बै?...

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

यहां हम देशी ग्रीन जेल ट्रो द्वारा solubilized thylakoid परिसरों को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । ग्रीन जेल बैंड बाद में समय की विशेषता है संबंधित एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) और डेटा विश्लेषण के लिए बुनियादी कदम प्रदान की जाती हैं ।

पालक Thylakoid के पृथक्करण देशी ग्रीन जेल ट्रो और बैंड द्वारा समय-संबंधित एकल फोटॉन गिनती का उपयोग करते हुए प्रोटीन परिसरों

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

यह विधि प्रकाश संश्लेषण अनुसंधान के क्षेत्र में कुछ महत्वपूर्ण प्रश्नों का उत्तर देने के लिए उपयोगी है जैसे कि ख्यात थायलाकोइड कॉम्प्लेक्स ऊर्जावान रूप से जुड़े घटकों के साथ शारीरिक रूप से वास्तविक परिसर हैं? यहां वर्णित ग्रीन जेल और टीसीएसपीसी प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ यह है कि यह त्वरित और मजबूत है। नमूनों को आसानी से संसाधित किया जा सकता है और एक ही दिन में विश्लेषण किया जा सकता है, जिससे भंडारण और स्थिरता के मुद्दे चिंता का विषय कम हो जाते हैं।हालांकि टीसीएसपीसी प्रकाश संश्लेषण प्रणालियों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है जिसका हमने यहां अध्ययन किया है, इसे भौतिक और जैविक के माध्यम से रासायनिक से लेकर अन्य प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है जैसे तरल पदार्थ, कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट आणविक गति का अध्ययन, या मोनोमोल्यूलर परतों और आयनिक तरल पदार्थ जैसे उपन्यास-संरचनात्मक रूपांकन। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित आवश्यक स्टॉक समाधान और हरे रंग के मिनी जैल तैयार करें। इसके बाद, कुछ बर्फ प्राप्त करें और रोशनी को मंद करें।ग्लास डूनेस होमोजेनाइजर का उपयोग करके, टीएमके बफर के लगभग एक से दो मिलीलीटर में पालक के पत्तों को पूरी तरह से समरूप करें। एक साधारण फ़िल्टरिंग डिवाइस बनाने के लिए, एक नाजुक कार्य को आधे में काट लें और इसे तिमाहियों में मोड़ें। एक सिरिंज से प्लंजर निकालें, और फिर सिरिंज के नीचे में मुड़ा हुआ कार्य पोंछ पैक करें।पाइपेट पत्ती को कार्य-पोंछ फिल्टर के केंद्र में बदल देते हैं, फिर फिल्टर के माध्यम से समरूप को पारित करने के लिए प्लंजर का उपयोग करें और इसे 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र करें। थायलाकोइड झिल्ली सहित अघुलनशील सामग्री को गोली मारने के लिए 10 मिनट के लिए 5, 000 ग्राम और चार डिग्री सेल्सियस पर समरूपता। सुपरनेट को त्यागें और टीएमके बफर के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।प्रत्येक नमूने से क्लोरोफिल निकालने के लिए, 50-माइक्रोलीटर एलिकोट लें और इसे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। मेथनॉल के 950 माइक्रोलीटर जोड़ें, ट्यूब को कैप करें, और इसे कई बार उलटा करके मिलाएं। उपजी प्रोटीन को गोली मारने के लिए 10 मिनट के लिए 10, 000 ग्राम पर सेंट्रलाइज।एक गाइड के रूप में क्लोरोफिल एकाग्रता माप का उपयोग करना, प्रत्येक नमूने से कुछ मात्रा को हटाएं और त्यागें जब तक कि प्रत्येक ट्यूब में क्लोरोफिल की कुल मात्रा न हो। थायलाकोइड झिल्ली को फिर से गोली मारने के लिए 10 मिनट के लिए 5, 000 ग्राम पर सेंट्रलाइज। गोली को परेशान किए बिना सभी सुपरनिटेंट को हटाने और छोड़ने के लिए सावधान रहें।सबसे पहले, TMK 30% ग्लिसरोल डिटर्जेंट समाधान का एक aliquot गल । उलटा कई बार मिश्रण और बर्फ पर समाधान रखने के लिए। गोली को भंग करने के लिए डिटर्जेंट समाधान की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें और परिणामस्वरूप एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम क्लोरोफिल एकाग्रता हो।नमूना में झाग से बचने के लिए सावधान रहने के दौरान बार-बार पिपेट करें। फिर, थायलाकोइड नमूनों को घुलनशील करने की अनुमति देने के लिए बर्फ पर नमूना रखें। घुलनशीलता पूरी होने के बाद, अघुलनशील सामग्री को गोली मारने के लिए 10, 000 ग्राम और चार डिग्री सेल्सियस पर नमूना 10, 000 ग्राम और चार डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें, जिसके परिणामस्वरूप एक स्पष्ट, गहरे हरे रंग का सुपरनैंट होता है।इसके बाद, पहले से तैयार 1.5 मिलीमीटर देशी जेल के प्रत्येक कुएं पर सीधे घुलनशील थाइलाकोइड सुपरनेटेंट के 15 माइक्रोलीटर लोड करें। 1X रनिंग बफर का उपयोग करके, 100 वोल्ट पर देशी हरे रंग के जेल को चलाना शुरू करें। प्रतिरोधी हीटिंग को कम करने के लिए रन की अवधि के लिए गीले बर्फ पर पूरे जेल टैंक रखें।जब जेल चल रहा है, यह इलेक्ट्रोफोरेसिस सेल से हटा दें और आसुत पानी के साथ जेल प्लेटों के बंद चल बफर कुल्ला । जेल से ऊपर की प्लेट निकालें और फिर आसुत पानी के साथ जेल कुल्ला। जेल रखें, जो अभी भी नीचे कांच की प्लेट पर है, बर्फ पर; जब जेल उपयोग में नहीं है, इसे प्लास्टिक की चादर से कवर करें और इसे सूखने से रोकने के लिए अंधेरे में रखें।इसके बाद, टीसीएसपीसी विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार होने पर ब्याज के प्रत्येक बैंड को उत्पादित करने के लिए शार्प स्केलपेल या रेजर ब्लेड का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि उत्पादित बैंड में कोई दूषित बैंड सामग्री नहीं है। प्रत्येक परिसर का विश्लेषण किया जा रहा है के लिए, 600 और 800 नैनोमीटर के बीच एक कमरे के तापमान फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम बनाने के लिए एक फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें।स्लाइड के दोनों छोर पर मास्किंग टेप रखें और स्पेसर्स बनाने के लिए इसे कई बार मोड़ें, जो स्लाइड के बीच की जगह को संकुचित किए बिना मजबूती से एक साथ आयोजित होने की अनुमति देगा, फिर दो ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड के बीच जेल स्लाइस को सैंडविच करें। एक चिकनी इंटरफेस बनाने के लिए ग्लास स्लाइड के किनारे पर जेल स्लाइस में थोड़ी मात्रा में पानी जोड़ें जो सिग्नल बिखरने को कम करेगा। इसके बाद, बीम पथ में जेल सैंडविच को दबाएं ताकि बीम प्लेटों के खुले किनारे के माध्यम से जेल स्लाइस पर हमला करे।प्रत्येक परिसर के लिए, फ्लोरेसेंस उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में नियमित अंतराल पर 10, 000 कुल डेटा अंक एकत्र करें। किसी दिए गए परिसर के लिए डेटा का विश्लेषण करने के लिए, पहले एकत्र किए गए तरंगदैर्ध्य के सभी के लिए प्रत्येक क्षय वक्र की अधिकतम ऊंचाई को सामान्य करें, फिर पूंछ पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित परिसर के स्थिर राज्य फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम के लिए प्रत्येक क्षय वक्र से मेल खाती है। ग्रीन जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए प्रतिनिधि परिणाम पालक थायलाकोइड्स के विश्लेषण के लिए एक आदर्श परिणाम का उदाहरण प्रदान करता है, जहां कई स्पष्ट, तेज हरे रंग के बैंड दिखाई देते हैं।लेन 2 और 3 एक गैर-ढाल 5% एक्रिलामाइड जेल पर सरल थायलाकोइड अलगाव और इलेक्ट्रोफोरेसिस से अधिक विशिष्ट परिणाम प्रस्तुत करते हैं। लेन 4, 5, और 6 थायलाकोइड नमूने के कम घुलनशीलता की बढ़ती डिग्री के कारण खराब परिणामों का एक उदाहरण प्रदान करते हैं, जबकि लेन 7 उन परिणामों को दर्शाता है जो पालक के बजाय अरबीडोप्सिस थायलाकोइड का उपयोग किए जाने पर प्राप्त किए जा सकते हैं। टीसीएसपीसी डेटा के डेटा वक्र्स को एक ही समय रजिस्टर करने के लिए सेट किए जाने के बाद, उन्हें उसी पीक ऊंचाई तक सामान्यीकृत किया जा सकता है, जो डेटा के पहले विश्लेषण के रूप में घटता की तुलना करने की अनुमति देता है।विभिन्न परिसरों से पीक-सामान्यीकृत क्षय घटता है तो एक दिए गए तरंगदैर्ध्य पर एक दूसरे के साथ मढ़ा जा सकता है, परिसरों के बीच व्यवहार में अंतर की कल्पना करने की अनुमति देता है। क्षय घटता मिलान पूंछ क्षय से जुड़े स्पेक्ट्रा के निर्माण के लिए अनुमति देता है। जैसा कि यहां देखा गया है, एलएचसीआईआई के लिए क्षय से जुड़े स्पेक्ट्रा गतिशील सुविधाओं की कमी के लिए उल्लेखनीय है और एलएचसीआईआई फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम का आकार समय के साथ संकेत क्षय के समान रहता है।फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम के क्षय में भी देरी होती है, अधिकतम फ्लोरेसेंस तक पहुंचने के लिए 100 पिकोसेकंड की आवश्यकता होती है। इससे पता चलता है कि ऊर्जा को परिसर के भीतर ऊर्जावान रूप से अलग वर्णक के बीच स्थानांतरित नहीं किया जाता है क्योंकि फ्लोरेसेंस क्षय होता है। इसके बाद बैंड 5 कॉम्प्लेक्स के लिए क्षय से जुड़े स्पेक्ट्रा का निर्माण किया जाता है ।एलएचसीआईआई की तुलना में, बैंड 5 से फ्लोरेसेंस बहुत अधिक तेजी से क्षय होता है, केवल 30 पिकोसेकंड में अधिकतम तीव्रता तक पहुंचता है और फिर 500 पिकोसेकंड के बाद प्रारंभिक तीव्रता के 20% से कम तक क्षय होता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि टीसीएसपीसी डेटा की व्याख्या अध्ययन के तहत परिसरों के घटकों की पहचान करने वाली अतिरिक्त जैव रासायनिक जानकारी पर निर्भर करेगी, उदाहरण के लिए, 2 डीएसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा।

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Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

संयंत्र घुलनशील प्रोटीन और सुपाच्य कार्बोहाइड्रेट सामग्री को बढ़ाता है, एक अनुकरणीय के रूप में मकई (Zea mays) का उपयोग

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

पारंपरिक आरटी-पीसीआर और SYBR ग्रीन आरटी-qPCR का उपयोग कर Tilapia झील वायरस का पता लगाने

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...