Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
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Finanziamento e sostegno sono stati forniti dal dipartimento di chimica presso la Michigan State University.

1. magazzino soluzioni preparazione per colata gel verde nativo
<ol><li>Preparare una soluzione tampone concentrata di 4x per la risoluzione di gel composto da 40% glicerolo, glicina di 200 mM e 100 mM Tris tamponato a pH 8.3.</li>
	<li>Preparare una soluzione tampone concentrata di 4x per stacking gel composto da 40% glicerolo, glicina di 200 mM e 100 mM Tris tamponato a pH 6,3.</li>
	<li>Memorizzare i buffer a 4 ° C per prevenire la crescita di muffa. Nota: I buffer sono stabili per mesi a 4 ° C, quindi è consi...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

Un successo thylakoid solubilizzazione e Natale gel eseguire comporterà la risoluzione di più distinte bande verde visibile sul gel senza distorsione significativa o sbavature delle bande. Sovraccaricare il gel, un'alta concentrazione di detersivo, un pH di esempio errato, non disciolto materiale, correre il gel troppo rapidamente o ad una temperatura troppo elevata, e un gel indebitamente versato sono tutti fattori che possono contribuire alla mal risolto thylakoid complessi. Ottimizzando le condizioni del gel stesso ...

Gli organismi fotosintetici devono regolare costantemente la loro fisiologia alle mutevoli condizioni ambientali, per massimizzare la loro produttività e competere con successo con i vicini1. Questo è particolarmente vero per il macchinario responsabile per le reazioni di luce della fotosintesi, come luce ambientale condizioni possono fluttuare da tre ordini di grandezza tra ombre e pieno sole. Inoltre, fattori ambientali, come siccità, freddo o lo stress da calore possono ridurre la disponibilità di anidride carbonica per la fissazione del carbonio, che è il lavandino elettrone naturale per i prodotti delle reazioni luce. Piante devono, pertanto, raccolto e utilizzano la radiazione solare nel modo più efficiente possibile pur mantenendo la capacità di dissipare l'eccesso di energia luce necessaria. Mentre danno photooxidative persiste ordinariamente sotto tutte le condizioni di luce2,3, l'incapacità di gestire energia di eccitazione assorbita correttamente può portare a danni catastrofici delle cellule e la morte. Parecchi meccanismi adattivi esistono che permettono l'apparato fotosintetico essere sintonizzato sia cambiamenti nelle condizioni ambientali prevalenti e a fluttuazioni transitoria (cioè, più brevi e lunghi periodi di tempo)4. Questi includono la risposta a lungo termine (LTR) e non-fotochimica tempra (NPQ). NPQ è di per sé considerato a comprendere almeno tre altri fenomeni di componente, incluse le transizioni di stato (qT) ed energia rapidamente viscoelastica tempra (qE) fotoinibizione (qI)5.
Questi processi sono stati originariamente osservati e definiti in gran parte in termini di fenomeni spettroscopici [ad es., NPQ si riferisce a una goccia in fluorescenza clorofilla osservati (estinzione della fluorescenza della clorofilla) che non è dovuto ad un aumento del tasso di fotochimica]6. Il termine "transizioni di stato" si riferisce allo stesso modo al cambiamento osservato nella relativa quantità di fluorescenza da PSI e PSII7. Mentre le tecniche spettroscopiche che hanno reso possibile la enumerazione di questi fenomeni [in particolare, ampiezza di impulso modulata spettroscopia di fluorescenza (PAM)] e continuano ad essere uno strumento fondamentale per l'osservazione e la dissezione di processi fotosintetici in vivo, un ottimo affare di biochimica è richiesto per delucidare i meccanismi alla base di queste osservazioni spettroscopiche. Le transizioni di stato, per esempio, prevede un ciclo di fosforilazione/defosforilazione delle proteine LHCII dal STN7 chinasi e fosfatasi TAP38/PPH1, rispettivamente8,9,10. Questo ciclo di regola la distribuzione fisica dell'antenna LHCII tra due fotosistema spostando una parte dei trimeri LHCII da PSII PSI, modificando in tal modo l'assorbimento sezione trasversale del fotosistema11,12. Il componente qE di NPQ converte rapidamente energia di eccitazione in eccesso in calore attraverso le azioni del ciclo epossidazione/de-epossidazione violaxantina/zeaxantina e la proteina PsbS. Il ruolo esatto di PsbS in questo processo è ancora non pienamente compreso13. Il componente di qI di NPQ, fotoinibizione, è generalmente attribuito a danneggiare la proteina D1 del PSII. Restauro di competenza piena fotosintetico richiede un processo di riparazione elaborati per fissare danneggiato PSII photocenters. Il ciclo di riparazione PSII comporta la migrazione dei complessi PSII fuori il granal pile, smantellamento dei complessi, sostituzione di proteine danneggiate D1, rimontaggio dei complessi PSII e movimento dei complessi PSII nuovamente dentro il pile granal14. L'esatta natura di fotoinibizione e PSII photodamage rimane un argomento di esame accurato intenso15.
La difficoltà nello studio di fenomeni come stato transizioni o riparazione PSII deriva in parte dal fatto che c'è un modo semplice per visualizzare la meccanica dei sistemi biochimici complessi. Il classico approccio biochimico per comprendere un processo consiste nel separare prima suoi componenti in modo che essi possono essere caratterizzati in isolamento. Elettroforesi del gel nativo è sorto da iniziative di successo nel 1980 per separare e caratterizzano i complessi di fotosistema dalle membrane tilacoidali con più metodi preparativa (vale a dire la centrifugazione in gradiente di saccarosio e la cromatografia)16. I detergenti sistemi sviluppati per solubilizzare delicatamente i complessi nativi dalle membrane tilacoidali presto sono stati adattati ai metodi di separazione elettroforetica, in particolare da Allen e Staehelin17 ed e Peter e Thornber18, dando luogo a Natale verde gel elettroforesi. Mentre che rappresentano solo uno di una varietà di tecniche nell'arsenale sperimentale, PAGE nativo ha un numero di caratteristiche che lo hanno reso un metodo ampiamente impiegato nella ricerca di fotosintesi. PAGINA nativo è relativamente veloce e semplice, che richiede attrezzature poco specializzata, fornendo contemporaneamente separazione di alta risoluzione di un gran numero di complessi thylakoid. Questo rende la pagina nativa un comodo strumento per studiare thylakoid dinamica e, quando combinato con pagina standard nella seconda dimensione, nonché una varietà di sistemi tampone e detergente, un sistema versatile per trovare e caratterizzare nuovi thylakoid complessi.
Detto questo, gel verde nativo hanno avuto la reputazione di essere una tecnica inaffidabile, soprattutto in mani inesperte, in quanto è facile produrre scarsi risultati composto da gel fuzzy, untuosa con poche bande. Questo problema è stato risolto, in parte, con l'introduzione del blu-natale pagina19. L'uso della tintura di coommassie nel sistema di buffer BN rende la separazione delle proteine più robusto. Di conseguenza, BN-PAGE è spesso una tecnica più semplice e affidabile per un novizio relativa impostare e separazioni di alta risoluzione di thylakoid complessi in grado di fornire. Per questi motivi, BN-PAGE è diventato il metodo di scelta per la maggior parte del lavoro di questo campo. BN-PAGE è generalmente più lento per l'esecuzione di elettroforesi del gel di colore verde, il suo principale svantaggio è che la colorazione di tintura coommassie interferisce con l'identificazione delle fasce deboli contenenti clorofilla, rendendo anche a valle spettroscopiche caratterizzazione problematico.
Le informazioni biochimiche fornite da gel nativo e SDS-PAGE 2D può essere notevolmente rafforzata quando combinati con dati di tecniche spettroscopiche. Indipendentemente dal sistema impiegato, un problema centrale con l'utilizzo di gel nativo per identificare complessi è che l'identificazione può sempre essere impugnata (cioè, le proteine trovate in una band potrebbe sempre rappresentare comigrating complessi o componenti, piuttosto di un unico complesso fisiologicamente autentico). Caratterizzazione spettroscopica fornisce informazioni biofisiche i pigmenti in bande di gel verde e può essere utilizzato per determinare quali tipi di complessi sono propensi a contenere. Fluorescenza della clorofilla è particolarmente utile a questo proposito a causa della spesso drammaticamente differenti spettri e durate di fluorescenza che sono caratteristici dei complessi pigmento-proteici fotosintetici differenti. Mentre gli spettri di fluorescenza di semplice allo steady-state 77K sono stati storicamente utili nel confermare l'identità dei complessi di Natale del gel, moderno correlati nel tempo singolo fotone conteggio (TCSPC) è in grado di fornire molte più informazioni. TCSPC permette non solo la caratterizzazione di complessi basati sulla durata di fluorescenza, ma rende anche possibile la descrizione dettagliata del trasferimento di energia tra componenti spettrali all'interno di un complesso. Questo tipo di caratterizzazione sta diventando sempre più necessario come l'uso di varie creme di sistemi di Natale del gel e vengono scoperti nuovi presunti complessi, permettendo l'identificazione di complessi proteici di meglio essere autenticati e offrire nuovi biofisiche informazioni sul funzionano di questi complessi.
In questo articolo forniamo un metodo che permette a coloro che hanno poca o nessuna esperienza con elettroforesi nativa per ottenere alta qualità risoluzione dei nativi thylakoid complessi allo scopo di indagare i meccanismi delle reazioni di luce fotosintesi. Questa tecnica di base può poi essere aumentata a discrezione dello sperimentatore di migliorare i risultati o estendere l'applicabilità di altre specie. Quindi si descrive il processo per il soggetto bande di gel verde nativo di TCSPC, come pure alcuni passaggi per analisi di base e la presentazione dei dati forniti dalla tecnica. L'accoppiamento di elettroforesi nativa con analisi TCSPC estende l'utilità di questi sistemi di gel fornendo l'autenticazione e la caratterizzazione biofisica dei complessi della proteina all'interno delle fasce. Il sistema gel verde qui descritto si basa su che sviluppato da Allen e Staehelin17 con alcune modifiche ed è lo stesso di quello utilizzato in Schwarz et al. 20. questo sistema è uno dei tanti, ma ha caratteristiche specifiche che sono utili per questa metodologia. È abbastanza veloce in modo che thylakoid isolamento, elettroforesi del gel e l'analisi TCSPC conveniente può essere eseguite in un solo giorno, prevenendo potenziali problemi di conservazione dei campioni e la degradazione. Troviamo anche che questo metodo è robusto nelle mani di utenti inesperti, pur fornendo risultati che vanno dal buono al superiore, a seconda del grado di ottimizzazione.
È importante da tenere a mente che i complessi visualizzati su un gel nativo dipendono da sistemi tampone sia il detergente utilizzati, nonché sulla biologia dell'organismo in esame. Diversi sistemi tampone e detergente preferenzialmente separano diversi tipi di complessi, e un dato organismo fotosintetico avrà diversi complessi da altri organismi, dei quali non tutti saranno presenti sotto qualsiasi circostanza. Il sistema qui descritto è particolarmente adatto allo studio del PSI megacomplexes, come descritto in Schwarz et al. 20, ma cade sull'estremità più destabilizzante dello spettro per coloro che studiano PSII megacomplexes. Per uno studio completo dei vari sistemi tampone e detergente utilizzato nel Natale del gel elettroforesi delle proteine tilacoide, si consiglia di rivedere Järvi et al. 21 e Rantala et al. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

Le reazioni di luce di fotosintesi sono effettuate da una serie di complessi proteici pigmentati nelle membrane tilacoidali. La stechiometria e l'organizzazione di questi complessi è altamente dinamico su sia in lungo che in breve tempo scale a causa di processi che si adattano fotosintesi al mutare delle condizioni ambientali (cioè, non-fotochimica tempra, transizioni di stato e la risposta a lungo termine). Storicamente, questi processi sono stati descritti spettroscopicamente in termini di cambiamenti in fluorescenza della clorofilla, e spettroscopia rimane un metodo fondamentale per il monitoraggio di parametri fotosintetici. Ci sono un numero limitato di modi in cui possono essere visualizzate le sottostanti dinamiche complesse della proteina. Qui descriviamo un metodo semplice e veloce per la separazione ad alta risoluzione e visualizzazione di thylakoid complessi, elettroforesi del gel verde nativo. Questo metodo è accoppiato con correlati nel tempo singolo fotone conteggio per la dettagliata caratterizzazione delle proprietà di fluorescenza clorofilla di bande separate sul gel verde.

Risultati rappresentativi per elettroforesi del gel di colore verde sono presentati nella Figura 1. Lane 1 fornisce un esempio di risultati ideali per elettroforesi del gel verde di spinaci tilacoidi, in cui è visibile un numero massimo di bande verdi chiare e nitide. Questi risultati sono un po' atipici, in parte perché non tutte le bande vista nel vicolo 1 sono normalmente presenti in un dato campione. Pulitura di esempio aggiuntivi, sotto forma di isolam...

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Qui presentiamo un protocollo per separare solubilizzate thylakoid complessi mediante elettroforesi in Gel verde nativo. Gel verde bande successivamente sono caratterizzati da tempo correlato Single Photon Counting (TCSPC) e vengono forniti i passaggi base per l'analisi dei dati.

Separazione di spinaci Thylakoid complessi proteici da nativo verde Gel elettroforesi e caratterizzazione di banda utilizzando Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Questo metodo è utile per rispondere ad alcune domande chiave nel campo della ricerca sulla fotosintesi come i complessi tilakoidi putativi complessi fisiologicamente reali con componenti energeticamente connessi? Il vantaggio principale del gel verde e del protocollo TCSPC descritto qui è che è veloce e robusto. I campioni possono essere facilmente elaborati e analizzati in un solo giorno, rendendo meno preoccupanti i problemi di archiviazione e stabilità.Sebbene il TCSPC possa fornire informazioni sui sistemi fotosintetici che abbiamo studiato qui, può anche essere applicato ad altri sistemi che vanno dalla chimica alla fisica e biologica come studi di moto molecolare fluorescente in liquidi, cellule o motivi nuovi-strutturali come strati monomolecolari e liquidi ionici. Per iniziare questa procedura, preparare le soluzioni stock necessarie e i mini gel verdi come delineato nel protocollo di testo. Quindi, ottenere un po 'di ghiaccio e fioca le luci.Utilizzando un omogeneizzatore Dounce in vetro, omogeneizzare completamente le foglie di spinaci in circa uno o due millilitri di tampone TMK. Per creare un semplice dispositivo di filtraggio, tagliare a metà una delicata cancellazione delle attività e piegarla in quarti. Rimuovere lo stantuffo da una siringa, quindi imballare la pulitura dell'attività piegata nella parte inferiore della siringa.Pipettare l'omogeneo foglia al centro del filtro task-wipe, quindi utilizzare lo stantuffo per passare l'omogeneo attraverso il filtro e raccoglierlo in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare l'omogeneato a 5.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettizzare il materiale insolubile, comprese le membrane tilacoidi. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di tampone TMK.Per estrarre la clorofilla da ciascun campione, prendere un'aliquota di 50 microlitri e trasferirla in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere 950 microlitri di metanolo, limitare il tubo e mescolare inverterlo più volte. Centrifuga a 10.000 g per 10 minuti per pellettare le proteine precipitate.Utilizzando le misurazioni della concentrazione di clorofilla come guida, rimuovere e scartare un po 'di volume da ciascun campione, se necessario, fino a quando ogni tubo non contiene la stessa quantità totale di clorofilla. Centrifugare a 5.000 g per 10 minuti per ri-pellettare le membrane tilacoidi. Rimuovere e scartare il supernatante, facendo attenzione a rimuovere tutto il supernatante senza disturbare il pellet.In primo luogo, scongelare un'aliquota di soluzione detergente TMK 30%glicerolo. Invertire più volte per mescolare e mantenere la soluzione sul ghiaccio. Aggiungere un volume appropriato della soluzione detergente per sciogliere il pellet e provocare una concentrazione finale di clorofilla di un milligrammo per millilitro.Pipetta su e giù ripetutamente mentre si fa attenzione a evitare schiuma nel campione. Quindi, tenere il campione sul ghiaccio per consentire ai campioni di thylakoid di solubilizzare. Al termine della solubilizzazione, centrifugare il campione a 10.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettizzare il materiale insolubile, risultando in un supernatante verde scuro chiaro.Successivamente, caricare 15 microlitri di supernatante tilakoide solubilizzato direttamente su ogni pozzo di un gel nativo da 1,5 millimetri precedentemente preparato. Utilizzando 1X running buffer, iniziare a eseguire il gel verde nativo a 100 volt. Posizionare l'intero serbatoio del gel sul ghiaccio bagnato per tutta la durata della corsa per mitigare il riscaldamento resistivo.Quando il gel ha finito di funzionare, rimuoverlo dalla cella di elettroforesi e risciacquare il tampone di corsa dalle piastre di gel con acqua distillata. Rimuovere la piastra superiore dal gel e quindi risciacquare il gel con acqua distillata. Posizionare il gel, che è ancora sulla piastra di vetro inferiore, sul ghiaccio;Successivamente, utilizzare un bisturi affilato o una lama di rasoio per asportare ogni banda di interesse quando si è pronti a procedere con l'analisi TCSPC. Assicurarsi che la fascia asportata non contenga materiale a banda contaminante. Per ogni complesso analizzato, utilizzare uno spettrometro fluorescente per creare uno spettro fluorescente a temperatura ambiente compreso tra 600 e 800 nanometri.Posizionare il nastro adesivo su entrambe le estremità delle diapositive e piegarlo più volte per creare distanziale, che consentirà di tenere saldamente insieme le diapositive senza comprimere lo spazio tra, quindi inserire la fetta di gel tra due diapositive di microscopia in vetro. Aggiungere una piccola quantità di acqua alla fetta di gel sul bordo delle diapositive di vetro per creare un'interfaccia fluida che riduca la dispersione del segnale. Successivamente, bloccare il sandwich di gel nel percorso del fascio in modo che il fascio colpisca la fetta di gel attraverso il bordo aperto delle piastre.Per ogni complesso, raccogliere 10.000 punti dati totali a intervalli regolari attraverso lo spettro di emissione di fluorescenza. Per analizzare i dati per un dato complesso, prima normalizza l'altezza di picco di ogni curva di decadimento per tutte le lunghezze d'onda raccolte, quindi la coda corrisponde a ogni curva di decadimento allo spettro di fluorescenza dello stato stazionario del complesso come delineato nel protocollo di testo. Risultati rappresentativi per l'elettroforesi del gel verde forniscono un esempio di risultato ideale per l'analisi dei thylakoidi spinaci, dove sono visibili un certo numero di bande verdi chiare e affilate.Le corsie 2 e 3 presentano risultati più tipici del semplice isolamento dei tilacoidi e dell'elettroforesi su un gel di acrilammide non gradiente del 5%. Le corsie 4, 5 e 6 forniscono un esempio di scarsi risultati dovuti all'aumento dei gradi di sotto solubilizzazione del campione di thylakoid, mentre la corsia 7 dimostra i risultati che si possono ottenere quando vengono utilizzati thylakoidi arabidopsis al posto degli spinaci. Dopo che le curve di dati dei dati TCSPC sono state impostate sullo stesso registro di tempo, possono essere normalizzate alla stessa altezza di picco, il che consente di confrontare le curve come prima analisi dei dati.Le curve di decadimento normalizzate a picco da diversi complessi possono quindi essere sovrapposte l'una all'altra ad una data lunghezza d'onda, permettendo di visualizzare le differenze di comportamento tra i complessi. La coda che corrisponde alle curve di decadimento consente la costruzione di spettri associati al decadimento. Come visto qui, gli spettri associati al decadimento per il LHCII sono notevoli per la mancanza di caratteristiche dinamiche e la forma dello spettro di fluorescenza LHCII rimane la stessa del decadimento del segnale nel tempo.Anche il decadimento dello spettro di fluorescenza è ritardato, richiedendo 100 picosecondi per raggiungere la massima fluorescenza. Ciò suggerisce che l'energia non viene trasferita tra pigmenti energeticamente distinti all'interno del complesso man mano che la fluorescenza decade. Gli spettri associati al decadimento vengono quindi costruiti per il complesso della Banda 5.Rispetto al LHCII, la fluorescenza della Banda 5 decade molto più rapidamente, raggiungendo l'intensità massima in soli 30 picosecondi e quindi decadendo a meno del 20% dell'intensità iniziale dopo 500 picosecondi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'interpretazione dei dati TCSPC si baserà su ulteriori informazioni biochimiche che identificano i componenti dei complessi in esame, ad esempio da 2 DSDS-PAGE e Western Blotting o spettrometria di massa.

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