Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
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資金援助と支援は、ミシガン州立大学で化学の部門によって提供されました。

1. 貯蔵液準備、ネイティブの緑のジェルを注入
<ol><li>40% のグリセロール、200 mM と 100 mM Tris バッファー ph 8.3 から成るゲルを解決するため濃縮緩衝液 × 4 を準備します。</li>
	<li>40% のグリセロール、200 mM と 100 mM Tris バッファー ph 6.3 から成るスタッキングのゲルの濃縮緩衝液 × 4 を準備します。</li>
	<li>カビの増殖を防ぐために 4 ° C でこれらのバッファーを格納します。 注: バッファー?...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

成功したチラコイドの可溶化とネイティブのゲルを実行は、大幅な歪みのないゲルの複数の明確な表示緑バンドの解像度またはバンドのスミアになります。ゲルをオーバー ロード、高濃縮、不適切なサンプル pH、不溶材料、速すぎるまたは高すぎる温度でゲルを実行して不適切に注がれたゲルが不十分な解決チラコイド錯体に貢献するかもしれないすべての要因。ゲル自体の条件を最適化し...

光合成生物は常に彼らの生産性を最大化し、隣人1正常に競う環境条件の変化に自分の生理機能を調整する必要があります。これは周囲の光影と完全な日光の間 3 つの一桁によって変動することが条件として、光合成の明反応に責任がある機械の特に当てはまります。さらに、干ばつ、冷、熱ストレスなどの環境要因は炭素固定、光反応の製品の自然の電子のシンクであるため二酸化炭素の可用性を減らすことができます。植物は、必要があります、したがって、収穫し、必要に応じて余分な光エネルギーを消費する能力を維持しながら日射をできるだけ効率的に活用します。一方、光酸化損傷はまだすべて光の条件2,3、管理の失敗の下で日常的に発生、吸収励起エネルギーが正常に壊滅的な細胞の損傷と死につながることができます。光合成装置の一般的な環境条件の変化と過渡変動 (すなわち、長くて短いタイム スケールで)4の両方を調整することができるいくつかの適応メカニズムが存在します。長期的な応答 (LTR) と非光化学消光 (NPQ) が含まれます。状態遷移 (qT)、急速に誘導エネルギー焼入 (qE)、光阻害 (qI)5を含む少なくとも 3 つの他のコンポーネント現象を包含すると考え自体は NPQ です。
これらのプロセス最初の観察・分光現象面で大きく定義 [例えばNPQ を指しますドロップ率の増加によるものではない (クロロフィル蛍光の消光) 観察されたクロロフィル蛍光の光化学]6。「状態遷移」という用語は同様に PSI と PSII7から蛍光性の相対的な量変化を指します。これらの現象の列挙を可能にした分光学的手法をしながら [特に、パルス振幅変調 (PAM) 蛍光分光法] 観察し、で光合成プロセスを切り裂くのための不可欠な手段であり続けるとvivo、多大な生化学のこれらの分光観測を基になる機構を解明する必要です。状態遷移には、例えば、STN7 キナーゼとホスファターゼ TAP38/PPH1、それぞれ8,9,10によって LHCII 蛋白質のリン酸化/脱燐酸化のサイクルが含まれます。このサイクルは、PSII から PSI、それによって吸収が変更に LHCII スチレンダイマーの一部を移動して 2 つダメージを与える間 LHCII アンテナの物流を調整しますダメージを与える11,12の断面図。NPQ の qE コンポーネントは、ビオラキサンチン/ゼアキサンチン エポキシ化/デ-エポキシ化サイクルと PsbS 蛋白質の行動を通して熱に余分な励起エネルギーを急速に変換します。この過程で PsbS の正確な役割はまだ完全に理解した13。NPQ、光阻害の qI コンポーネントは一般的に、PSII の D1 タンパク質にダメージを与えるせいにしました。完全光合成能力の回復には、破損した PSII photocenters を修正する精巧な修復プロセスが必要です。PSII 修繕周期には、PSII 錯体、グラナのスタックの複合体の解体、破損した D1 タンパク質の交換、PSII の複合体の再構築とグラナ スタック14に戻る光化学複合体の動きからの移行が含まれます。PSII 症状や光阻害の正確な性質のまま15強い精査の主題です。
遷移状態のような現象を研究の難しさや、PSII 修理に起因しない複雑な生化学システムの仕組みを可視化する 1 つの簡単な方法があるという事実の一部。プロセスを理解する古典的な生化学的アプローチは、最初にそのコンポーネントを切り離すことで、単独で特徴付けられます。ネイティブ電気泳動は分離しより多くの分取方法 (すなわちショ糖勾配遠心法とクロマトグラフィー)16チラコイド膜から光化学系複合体を特徴付けるに 1980 年代の成功した努力から生まれた。優しくチラコイド膜からネイティブの複合体の可溶化開発洗剤システムはアレンと Staehelin17によって最も顕著に電気泳動分離法すぐに合わせられたとピーターと Thornber18上昇を与えるネイティブ グリーンにゲルの電気泳動を実行します。さまざまな実験のアーセナルでは、ネイティブのページでテクニックを表す 1 つだけが光合成の研究で広く使用されている方法を作ったそれ魅力的な特性の数。ネイティブのページは比較的高速かつシンプルで、同時に多数のチラコイド錯体の高リゾリューションの分離を提供しながら、少し特殊な装置を必要とします。これはネイティブ ページをチラコイドのダイナミクスを研究するためと、さまざまな洗剤とバッファーのシステムを発見し、新しいチラコイド錯体を特徴付けるのため汎用性の高いシステムと同様に、2 番目の次元の標準ページと組み合わせると便利なツールになります。
ネイティブの緑のジェルと抱えている特に経験の浅い手での信頼性の低い手法であるという評判だが簡単にいくつかのバンドが付いているファジィ、べたつくゲルから成る悪い結果を生成します。この問題は、一部、青ネイティブ ページ19の導入で解決されました。BN バッファー システムの coommassie 色素の使用は蛋白質の分離をより強固になります。したがって、BN ページを設定する相対的な初心者のための簡単かつより信頼性の高い技術は、しばしば、チラコイド錯体の高解像度版を提供することができます。これらの理由から、BN-PAGE - このフィールドのほとんどの仕事のための選択の方法となっています。BN-PAGE - が一般的にその主な欠点は、緑のゲルの電気泳動よりも実行に時間がかかる coommassie 染料染色も下流ながらかすかなクロロフィルを含むバンドの同定と干渉する分光特性が問題となります。
ネイティブのゲルに生化学的な情報提供し、分光学的手法からのデータと組み合わせると、2次元 SDS ページを大幅強化することができます。採用システムにかかわらず複合体を識別するネイティブのゲルを使用して中心の問題であること識別は、常に挑戦することができます (すなわち、蛋白質バンドで発見可能性があります常に comigrating 複合体またはコンポーネントを表すではなく単一生理学的本格的な複雑なより)。分光法によるキャラクタリゼーションと生物物理について緑のゲルのバンドの色素複合体のどのような種類が含まれている可能性を決定するため使用することができます。クロロフィル蛍光は、しばしば劇的に異なるスペクトルと異なる光合成色素蛋白複合体の特徴である、蛍光寿命のためにこの点で特に便利です。簡単な定常 77 K 蛍光スペクトルを歴史的にネイティブ ゲル複合体の身元を確認するのに役立つされている、現代時間相関単一フォトンカウンティング (ピコ) より多くの情報を提供できます。ピコだけでなく蛍光寿命に基づく複合体の特性がまた可能、複雑なスペクトル成分間のエネルギー移動の詳細な説明になります。特性のこの種は様々 なネイティブ ゲル系スプレッドの使用としてますます必要になっているとより良い認証するタンパク質複合体の同定ができ、新しいを提供する、新しい推定錯体を発見これらの複合体のしくみの生物物理については。
本稿で我々 はネイティブ チラコイド複合体の光反応のメカニズムを検討するための高品質の解像度を達成するためにネイティブ電気泳動とほとんど、あるいは全くの経験を有することができる方法を提供します。光合成。この基本的な方法は、結果を改善または他の種への適用性を拡張する実験者の裁量で拡張できます。我々 は、基本的な分析と技術によって提供されるデータのプレゼンテーションのためのいくつかの手順と同様に、ピコ、ネイティブの緑のゲルのバンドを施すプロセスをについて説明します。ピコによるネイティブ電気泳動のカップリングは、認証およびバンド内タンパク質複合体の生物物理学的特性を提供することによってこれらのゲル系のユーティリティを拡張します。ここで説明した緑色のジェル システムは、いくつかの変更とアレンと Staehelin17によって開発された、シュワルツらと同じに基づいています。20です。 このシステムは、多くの一つですが、役にこの方法は、特定の機能を備えています。だは十分に急速、チラコイドの単離、ゲルの電気泳動とピコ解析便利なことができます実行されるので、1 日でサンプル ストレージと劣化の潜在的な問題がなくなります。また、このメソッドは、まだ最適化の程度によっては、優れた良いからその範囲の結果を提供しながら、経験の浅いユーザーの手に強力なを見つけます。
調査の下で生物学だけでなく、使用する洗剤とバッファーの両方のシステムでネイティブ ゲル上で可視化複合体依存心に負担することが重要です。洗剤とバッファーの異なるシステムが優先的に複合体のさまざまな種類を分離し、与えられた光合成生物はすべては、与えられた状況下で提示されます、他の生物から別の複合体を持っています。ここで説明したシステムは、シュワルツらで説明されている PSI megacomplexes の研究に特に適しています。20しかしそれ PSII megacomplexes を学習者がスペクトルのより不安定の端にあたります。チラコイドのタンパク質のネイティブ電気泳動で使用される様々 な洗剤とバッファー システムの包括的な研究は、ヤルヴィらを確認することをお勧めします。21と Rantalaら22。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

光合成の明反応はチラコイド膜の色素タンパク質複合体のシリーズによって遂行されます。長くて光合成環境条件の変化に適応するプロセスにより短い時間スケールの化学量論とこれらの複合体の組織は非常にダイナミックな (すなわち、非光化学消光、状態遷移と長期的な応答)。歴史的に、これらのプロセスで説明されている分光変更の面でクロロフィル蛍光と分光法による光合成パラメーターを監視するための重要な方法に残る。基になるタンパク質の複雑なダイナミクスを視覚化できる方法は限られています。ここでシンプルかつ高速高分解能分離とチラコイド錯体、ネイティブの緑のゲルの電気泳動の可視化法について述べる。このメソッドは、時間相関単一光子計数バンド緑のゲルの分離のクロロフィル蛍光特性の詳細な評価のために結合されています。

緑のゲルの電気泳動の代表的な結果は図 1に示した。車線 1 は、ほうれん草のチラコイドは、はっきりした、鋭い緑バンドの最大数が表示されます緑のゲル電気泳動の理想的な結果の例を示します。これらの結果は、幾分非定型の一部レーン 1 で見られるバンドのすべてが通常ある特定のサンプル中に存在。その他のサンプルのクリーンアップ?...

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

ネイティブ グリーン ゲル電気泳動による可溶化されたチラコイドの複合体を分離するためのプロトコルをご紹介します。緑のゲルのバンドが後で時間相関単一光子計数 (ピコ) を特徴と、データ分析のための基本的な手順が提供されます。

Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブ グリーン ゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

この方法は、エネルギー的に接続された成分を有する生理学的に実際の複合体であるような光合成研究の分野で特定の重要な質問に答える上で有用である?ここで説明するグリーンゲルとTCSPCプロトコルの主な利点は、それが迅速かつ堅牢であるということです。サンプルは1日で簡単に処理および分析できるため、ストレージや安定性の問題が少なくなります。TCSPCは、ここで研究してきた光合成システムに関する洞察を提供することができますが、液体、細胞、または単分子層やイオン液体などの新しい構造モチーフにおける蛍光分子運動の研究など、化学的および生物学的に至るまで、他のシステムにも応用できます。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているように、必要なストック ソリューションと緑のミニゲルを準備します。次に、いくつかの氷を取得し、ライトを暗くします。ガラスDounceホモジナイザーを使用して、ほうれん草の葉をTMKバッファーの約1〜2ミリリットルで完全に均質化する。簡単なフィルタリングデバイスを作成するには、繊細なタスクワイプを半分にカットし、四分の一に折りたたみます。シリンジからプランジャーを取り出し、折りたたんだタスクをシリンジの底に詰め込みます。葉をタスクワイプフィルターの中央にホモゲネートし、プランジャーを使用してフィルターを通してホモゲネートを通過させ、1.5ミリリットルの遠心分離管に集める。ホモゲネートを5,000gおよび摂氏4度で遠心分離し、チラコイド膜を含む不溶性物質をペレットに10分間与える。上清を捨て、TMKバッファーの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。各サンプルからクロロフィルを抽出するには、50マイクロリットルのアリコートを取り出し、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。メタノールを950マイクロリットル加え、チューブをキャップし、数回反転して混ぜます。遠心分離機を10,000gで10分間ペレットし、沈殿したタンパク質をペレット化した。クロロフィル濃度測定を参考に、各チューブに同じ総量のクロロフィルが含まれるまで、必要に応じて各サンプルから体積を除去して廃棄します。5,000gで10分間遠心分離機を用い、チラコイド膜を再ペレット化する。上清を取り除き、ペレットを邪魔することなく上清をすべて除去するように注意してください。まず、TMK 30%グリセロール洗剤溶液のアリコートを解凍する。数回反転して溶液を氷の上に入れ、保ちます。適切な量の洗剤溶液を加えてペレットを溶解し、1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度を得る。ピペットはサンプル中の泡立ちを避けるように注意しながら繰り返し上下します。その後、チラコイドサンプルが可溶化できるようにサンプルを氷の上に保管します。可溶化が完了した後、不溶性物質をペレット化するために10,000gおよび摂氏4度で遠心分離し、透明で濃緑色の上清をもたらす。この後、可溶化したチラコイド上清の15マイクロリットルを、以前に調製した1.5ミリメートルの天然ゲルの各ウェルに直接ロードします。1Xランニングバッファを使用して、100ボルトでネイティブグリーンゲルの実行を開始します。ランの間、ゲルタンク全体を湿った氷の上に置き、抵抗加熱を軽減します。ゲルの作動が終了したら、電気泳動セルから取り出し、蒸留水でゲルプレートのランニングバッファをすすきます。ゲルから上板を取り出し、蒸留水でゲルをすすきます。底ガラス板に残っているゲルを氷の上に置き、ゲルが使用されていない場合はラップで覆い、乾燥を防ぐために暗闇の中に保管します。次に、TCSPC 分析を進める準備ができたら、鋭いメスまたはカミソリの刃を使用して、対象の各バンドを切除します。切除バンドに汚染バンド材料が含まれていることを確認します。分析される各複合体について、蛍光分光計を使用して、600~800ナノメートルの間に室温蛍光スペクトルを作ります。スライドの両端にマスキングテープを置き、それを数回折りたたんでスペーサーを作成し、間のスペースを圧縮せずにスライドをしっかりと一緒に保持し、2つのガラス顕微鏡スライドの間にゲルスライスを挟みます。ガラススライドの端にあるゲルスライスに少量の水を加え、信号散乱を低減する滑らかなインターフェースを作成します。次に、ビームがプレートの開いた端を通ってゲルスライスに当たるように、ゲルサンドイッチをビームパスにクランプします。各複合体について、蛍光発光スペクトル全体で一定間隔で10,000の合計データポイントを収集します。特定の複合のデータを分析するには、まず収集されたすべての波長について各減衰曲線のピーク高さを正規化し、次に、テキストプロトコルで概説されているように、各減衰曲線を複合体の定常状態蛍光スペクトルに合わせてテールします。グリーンゲル電気泳動の代表的な結果は、透明で鋭い緑色のバンドが多数見えるほうれん草のチラコイドの分析に理想的な結果の一例を提供する。Lanes 2および3は、非勾配5%アクリルアミドゲル上の単純なチラコイド単離および電気泳動からより典型的な結果を提示する。レーン4、5、および6は、チラコイドサンプルの可溶化下の程度の増加による悪い結果の例を提供し、レーン7は、ほうれん草の代わりにシロイヌズナ症のチラシイドを使用したときに達成できる結果を示している。TCSPC データのデータカーブが同じ時間レジスタに設定された後、それらは同じピーク高さに正規化することができ、データの最初の分析として曲線を比較することができます。異なる複合体のピーク正規化減衰曲線を、指定された波長で互いに重ね合わせて、複合体間の挙動の違いを視覚化することができます。減衰曲線に一致するテールは、減衰関連スペクトルの構築を可能にします。ここで見られるように、LHCIIの崩壊関連スペクトルは動的特徴の欠如のために顕著であり、LHCII蛍光スペクトルの形状は時間の経過とともに減衰する信号と同じままである。蛍光スペクトルの崩壊も遅れ、最大蛍光に達するために100ピコ秒を必要とする。これは、蛍光が減衰するにつれて、複合体内のエネルギーがエネルギーによって異なる顔料の間で伝達されないことを示唆している。減衰関連スペクトルはバンド 5 の複合体のために構築されます。LHCIIと比較すると、バンド5の蛍光ははるかに急速に減衰し、わずか30ピコ秒で最大強度に達し、500ピコ秒後の初期強度の20%未満に減衰します。この手順を試みる間、TCSPCデータの解釈は、例えば、2 DSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングまたは質量分析によって、研究中の複合体の成分を識別する追加の生化学的情報に依存することを覚えておくことが重要です。

Research

JoVE Journal

Environment

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

環境学

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

水中の農薬のモニタリングのための特性とパッシブサンプラーの応用

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

大気エアロゾルからの抽出および界面活性剤の特性評価

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

測定と土壌侵食と堆積土炭酸濃度農業経営に関連のパターンのマッピング

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

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植物性の水溶性タンパク質と消化性炭水化物含量の手本として使用してトウモロコシ (トウモロコシ) の定量化

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

ティラピア湖ウイルスを使用して従来 RT-PCR および SYBR の検出グリーン Rt-qpcr

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブ グリーン ゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離

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