Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
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자금 지원과 미시간 주립 대학에 화학의 부에 의해 제공 되었다.

1. 재고 솔루션 준비 네이티브 녹색 젤 쏟아져
<ol><li>40% 글리세롤, 200mm 글리신, 및 100 mM Tris pH 8.3에 버퍼의 구성 된 젤을 해결 하기 위한 집중된 버퍼 솔루션 x 4를 준비 합니다.</li>
	<li>겹쳐 쌓이는 젤 40% 글리세롤, 200mm 글리신, 100 mM Tris 버퍼 pH 6.3에 구성 된에 대 한 집중된 버퍼 솔루션 x 4를 준비 합니다.</li>
	<li>금형의 성장을 방지 하기 위해 4 ° C에서이 버퍼를 저장 합니다. 참고: 버퍼 되므로 ?...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

성공적인 thylakoid 가용 화 및 실행 기본 젤 중요 한 왜곡 없이 젤에 여러 가지 표시 녹색 밴드의 해상도 또는 밴드의 번짐 발생 합니다. 젤 오버 로드, 높은 세제 농도, 잘못 된 샘플 pH으 소재, 젤 너무 빠르게 또는 너무 높은 온도에서 실행 되며 잘못 부 젤 제대로 해결된 thylakoid 단지에 기여할 수 있는 모든 요소. 젤 자체의 조건 최적화 하는 동안 (예., 아크릴 그라데이션 농도), 그것은 관심의...

광합성 생물 끊임없이 변화 하는 환경 조건 그들의 생산성을 극대화 하 고 이웃1과 성공적으로 경쟁 하기 그들의 생리학을 조정 해야 합니다. 이 기계 주변광 조건 전체 햇빛과 그림자 사이 3 개의 크기 순서에 의해 변동 될 수 있습니다으로 광합성, 빛 반응에 대 한 책임의 특히 사실 이다. 또한, 가뭄, 감기, 또는 열 스트레스 같은 빛 반응의 제품에 대 한 자연 전자 싱크 탄소 고정을 위한 탄소가 산화물의 가용성을 줄일 수 있습니다. 식물 해야 합니다, 그리고 따라서 하 게 수확 하 고 필요에 따라 초과 빛 에너지를 발산 하는 능력을 유지 하면서 가능한 한 효율적으로 태양 복사를 활용. 반면 photooxidative 손상을 계속 발생 합니다 정기적으로 모든 조명 조건2,3, 실패 관리를 흡수 여기 에너지 성공적으로 치명적인 세포 손상과 죽음으로 이어질 수 있습니다. 몇 가지 적응 메커니즘 통용 환경 조건에서 변화 하 고 일시적인 변동 (즉, 길고 짧은 timescales 이상)4튜닝할 광합성 장치를 허용 하는 존재. 장기 응답 (LTR) 및 비-광화학 냉각 (NPQ) 포함 됩니다. NPQ 상태 전환 (qT), 냉각 (qE 급속 하 게 유도할 수 있는 에너지), 및 photoinhibition (제나라)5를 포함 하 여 적어도 3 개의 다른 구성 요소 현상, 포괄 하는 것으로 간주 그 자체 이다.
이러한 프로세스를 관찰 원래 되었고 광 현상으로 크게 정의 [예를 들어, NPQ 참조 한 방울의 속도 증가 때문만 아니다 (엽록소 형광의 냉각) 관찰된 엽록소를 형광에 광화학]6. "상태 전환" 유사 하 게 관찰 하는 의미에서 PSI과 PSII7에서 형광의 상대적인 양을 변경 합니다. 이러한 현상의 열거형으로 가능 하 게 만든 분 광 기법을 동안 [특히, 펄스 진폭 변조 (PAM) 형광 분광학] 계속 관찰 하 고 광합성 프로세스 에서 해 부를 위한 중요 한 수단 vivo, 훌륭한 제의로 생화학의 이러한 분 광 관측을 기본 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 필요한입니다. 상태 전환, 예를 들어, STN7 키 니 아 제 및 TAP38/PPH1 인산 가수분해 효소, 각각8,,910LHCII 단백질의 인 산화/dephosphorylation 주기를 포함 한다. 이 주기 조정 PSII에서 PSI, 그로 인하여 흡수 변화 LHCII trimers의 일부를 이동 하 여 두 개의 photosystems 사이 LHCII 안테나의 물리적 배포 photosystems11,12의 횡단면. 빠르게에 NPQ의 qE 구성 요소 violaxanthin/제 아 잔 틴 epoxidation/드-epoxidation 사이클과 PsbS 단백질의 활동을 통해 열 과도 여기 에너지를 변환합니다. 이 과정에서 PsbS의 정확한 역할은 여전히 하지 완전히 이해13. Photoinhibition, NPQ의 키 구성 요소는 일반적으로 PSII의 D1 단백질에 손상을 관찰 작용. 전체 광합성 능력의 복원 손상 된 PSII photocenters를 해결 하기 위해 정교한 복구 프로세스가 필요 합니다. PSII 수리 주기 PSII 단지는 granal 스택, 단지 철거, 손상 된 D1 단백질의 보충, PSII 단지의 리어셈블리 및 granal 스택14에 다시 PSII 단지의 움직임의 마이그레이션이 포함 됩니다. Photoinhibition PSII photodamage의 정확한 특성 강렬한 감시15의 주제에 남아 있다.
현상 상태 처럼 공부에 어려움 전환 또는 PSII 수리 부분에 복잡 한 생화학 시스템의 역학을 시각화 하기 위해 하나의 간단한 방법 사실에서 발생 합니다. 프로세스를 이해 하 고전 생 화 확 적인 방법은 고립에서 특성화 될 수 있도록 먼저 구성 요소를 별도 것입니다. 기본 젤 전기 이동 법 성공적인 노력에서 분리 하 고 더 많은 대리점 메서드 (즉 자당 기온 변화도 원심 분리 크로마토그래피)16thylakoid 막에서 photosystem 단지 특성화는 1980 년대에서 일어났다. 세제 시스템 부드럽게 solubilize thylakoid 막에서 네이티브 복합물을 개발 했다 곧 적응 전기 이동 별거 방법, 가장 주목할만 하 게 알 렌과 Staehelin17 과 베드로 Thornber18, 기한 네이티브 녹색 젤 전기 이동 법. 동안 다양 한 기술 실험 무기고, 기본 페이지에서에서 대표 단 하나 광합성 연구에 널리 고용된 방법 만든 매력적인 특성의 수를 있다. 기본 페이지는 상대적으로 신속 하 고 간단, thylakoid 복합물의 많은 수의 고해상도 분리를 동시에 제공 하면서 약간 특수 장비가 필요. 이것은 네이티브 페이지 thylakoid 역학을 공부 하 고, 두 번째 차원 다양 한 세제 및 버퍼 시스템, 찾기 및 새로운 thylakoid 단지에 대 한 다양 한 시스템에 있는 표준 페이지와 함께 하는 편리한 도구.
즉, 네이티브 녹색 젤 했다 특히 경험이 손에, 신뢰할 수 없는 기술을 위한 명망 그것은 쉽게 퍼지, 더럽혀진 젤 몇 밴드와 함께 구성 된 가난한 결과 생산. 이 문제가 블루 기본 페이지19의 소개와 함께, 일부 해결 되었다. BN 버퍼 시스템에서 coommassie 염료를 사용 하 여 보다 강력한 단백질 분리를 합니다. 따라서, BN 페이지 종종 상대 초보자 설정에 대 한 쉽고 더 안정적인 기술 이며 단지 thylakoid 고해상도 분판을 제공할 수 있습니다. 이러한 이유로, BN-페이지는이 분야의 대부분의 작업에 대 한 선택의 방법 되었다. BN-페이지는 일반적으로 그것의 주요 결점은 녹색 젤 전기 이동 법, 보다 실행 속도가 느린 동시 다운스트림 희미 한 엽록소를 포함 밴드, 식별과 방해 coommassie 염료 얼룩이 광 특성화 문제입니다.
기본 젤에서 생 화 확 적인 정보 제공 그리고 분 광 기술에서 데이터와 함께 2D SDS 페이지 크게 강화 될 수 있다. 고용 시스템에 단지를 식별 하기 위해 기본 젤을 사용 하 여 중앙 문제는 식별 도전 수 있습니다 항상 (즉, 단백질 밴드에서 찾을 수 항상 대표 comigrating 단지 또는 구성 요소, 오히려 보다는 하나의 순수 정통 복잡). 분 광 특성 녹색 젤 밴드 안료에 대 한 생물 정보를 제공 하 고 확인할 어떤 유형의 단지 그들은 포함 하는 데 사용 수 있습니다. 엽록소 형광은 종종 극적으로 다른 스펙트럼 및 형광 수명 다른 광합성 안료 단백질 복합물의 특성 때문에 이런 맥락에서 특히 유용 합니다. 간단한 정상 77 K 형광 스펙트럼 네이티브 젤 단지의 정체성 확인에 유용한 있다 역사적으로, 현대 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 훨씬 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. TCSPC 형광 수명에 따라 단지의 특성 뿐만 아니라 수 있습니다 하지만 또한 가능 하 게 내는 스펙트럼 구성 요소 간의 에너지 전달의 자세한 설명. 특성의이 종류는 다양 한 기본 젤 시스템 확산의 사용으로 점점 더 필요 해지고 있다 그리고 새로운 상 상속 단지 발견 더 나은 인증 단백질 복합물의 식별을 허용 하 고 제공 하는 새로운 이 단지 작동 하는 방법에 대 한 생물 정보입니다.
이 문서에서 제공 하는 거의 또는 전혀 경험과 네이티브 젤 전기 이동 법의 빛 반응의 메커니즘을 조사 하기 위해 네이티브 thylakoid 단지의 높은 해상도 달성 하는 데 그 수는 방법 광합성입니다. 이 기본적인 기술은 다음 결과 개선 또는 다른 종에 적용을 확장 하는 실험의 재량에 증강 수 있습니다. 우리는 다음 TCSPC, 기본 분석 및 기술에 의해 제공 하는 데이터의 프레 젠 테이 션에 대 한 몇 가지 단계를 네이티브 녹색 젤 밴드를 쓰는 과정을 설명 합니다. TCSPC 분석 기본 젤 전기 이동 법의 커플링 인증 및 밴드 내에서 단백질 복합물의 생물 특성을 제공 하 여 이러한 젤 시스템의 유틸리티를 확장 합니다. 여기에 설명 된 녹색 젤 시스템 기반으로 개발한 알 렌과 Staehelin17 일부 수정 하 고 슈왈츠 외에 사용 되는 동일 합니다. 20.이 시스템은 많은 중 하나입니다 하지만이 방법론에 대 한 유용한 특정 기능. Thylakoid 절연, 젤 전기 이동 법, 및 TCSPC 분석 편리 하 게 수행할 수 있습니다 하루에 샘플 저장 및 저하의 잠재적인 문제를 만듦으로써 그것은 충분히 빠른. 우리는 또한이 메서드는 결과 우수, 최적화의 정도 따라 좋은 제공 하면서 미숙한 사용자의 손에서 강력한 찾을.
명심 하는 네이티브 젤에 시각 단지 조사 유 기체의 생물학에 뿐만 아니라 사용 하는 세제 및 버퍼 시스템에 중요 하다. 다른 세제와 버퍼 시스템 우선적으로 분리, 단지의 다른 종류 그리고 주어진된 광합성 유기 체는 모두는 어떤 주어진된 상황에서 있을 것입니다, 다른 유기 체에서 다른 단지 것입니다. 여기서 설명 하는 시스템은 슈왈츠 외에 설명 된 대로 PSI 고급의 연구에 특히 적합 합니다. 20, 하지만 그것은 그 PSII 고급 공부에 대 한 스펙트럼의 더 불안정 끝에 떨어진다. Thylakoid 단백질의 네이티브 젤 전기 이동 법에 사용 되는 다양 한 세제 및 버퍼 시스템의 포괄적인 연구를 위해 Järvi 외를 검토 하는 것이 좋습니다. 21 그리고 Rantala 외. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

광합성의 빛 반응 thylakoid 막에 안료 단백질 복합물의 시리즈에 의해 수행 됩니다. 산출할 및이 단지의 길고 짧은 시간 비늘 광합성 환경 조건 변화에 적응 하는 프로세스 때문에 매우 동적 이다 (즉, 비-광화학 냉각, 상태 전환 및 장기 응답)입니다. 역사적으로, 이러한 프로세스는 시선 변화 측면에서 설명 엽록소 형광 그리고 분광학 광합성 매개 변수를 모니터링 하는 중요 한 방법에 남아 있다. 제한 된 수의 기본 단백질 복잡 한 역학 구상 될 수 있는 방법 있다. 여기는 고해상도 분리 및 thylakoid 단지, 네이티브 녹색 젤 전기 이동 법의 시각화를 위한 빠르고 간단한 방법에 설명합니다. 이 메서드는 시간 상관 단일 광자 밴드 녹색 젤에 분리의 엽록소 형광 특성의 상세한 묘사에 대 한 계산 된 결합 이다.

녹색 젤 전기 이동 법에 대 한 대표적인 결과 그림 1에 표시 됩니다. 레인 1 시금치 thylakoids, 명확 하 고 날카로운 녹색 밴드의 최대 수를 볼 수 있습니다의 녹색 젤 전기 이동 법에 대 한 이상적인 결과의 예를 제공 합니다. 이러한 결과 다소 불규칙 하 고, 일부 레인 1에서 본 밴드의 모든 정상적으로 주어진된 샘플에 존재 하기 때문에. 추가 샘플 정리,...

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

여기 선물이 solubilized thylakoid 단지 네이티브 그린 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 프로토콜. 녹색 젤 밴드는 이후 여 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 특징 및 데이터 분석을 위한 기본 단계 제공 됩니다.

시금치 기본 그린 젤 전기 이동 법 및 Time-Correlated 단일 광자 계산을 사용 하 여 밴드 특성화 Thylakoid 단백질 복합물의 분리

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

이 방법은 정력적으로 연결된 성분을 가진 생리학적으로 실제 복합체인 과 같은 광합성 연구 분야의 특정 주요 질문에 답하는 데 유용합니까? 여기에 설명된 녹색 젤 및 TCSPC 프로토콜의 주요 장점은 빠르고 견고하다는 것입니다. 샘플을 하루 만에 쉽게 처리하고 분석할 수 있으므로 저장 및 안정성 문제가 우려되지 않습니다.TCSPC는 우리가 여기에서 공부한 광합성 시스템에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 액체, 세포 또는 단일 분자 층 및 이온 액체와 같은 새로운 구조 적모의 형광 분자 운동의 연구와 같은 물리적 및 생물학적을 통해 화학물질에 이르기까지 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 스톡 솔루션과 녹색 미니 젤을 준비합니다. 다음으로 얼음을 얻고 조명을 어둡게 합니다.유리 두스균균제제를 사용하여 시금치 잎을 TMK 버퍼의 약 1~2밀리리터로 완전히 균질화합니다. 간단한 필터링 장치를 만들려면 섬세한 작업을 반으로 자르고 분기로 접습니다. 주사기에서 플런저를 제거한 다음 접힌 작업을 지우기 주사기 의 바닥에 포장합니다.파이펫 잎은 작업 닦기 필터의 중심으로 동형, 다음 필터를 통해 균모를 통과하고 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에서 수집 플런저를 사용합니다. 원심분리기는 틸라코이드 멤브레인을 포함한 불용성 물질을 10분 동안 5, 000g 및 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 상체를 버리고 TMK 버퍼의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 놓습니다.각 샘플에서 엽록소를 추출하려면 50 마이크로리터 알리쿼트(aliquot)를 사용하여 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다. 메탄올 950 마이크로리터를 넣고 튜브를 캡으로 만들고 여러 번 반전하여 섞습니다. 10, 000 g에서 10분간 원심분리기는 침전된 단백질을 펠릿합니다.엽록소 농도 측정을 가이드로 사용하여 각 튜브에 동일한 총 엽록소양이 포함될 때까지 필요에 따라 각 샘플에서 일부 부피를 제거하고 폐기합니다. 원심분리기 5, 000g에서 10분간 틸라코이드 멤브레인을 다시 펠렛합니다. 펠릿을 방해하지 않고 모든 상체를 제거하여 제거하십시오.먼저 TMK 30% 글리세롤 세제 용액의 알리쿼트를 해동합니다. 여러 번 반전하여 얼음에 용액을 혼합하고 유지하십시오. 펠릿을 용해하고 밀리리터당 1밀리그램의 최종 엽록소 농도를 초래하기 위해 세제 용액의 적절한 부피를 추가합니다.샘플에서 거품을 피하기 위해 주의하면서 반복적으로 피펫위아래로 피펫. 그런 다음, 틸라코이드 샘플이 용해될 수 있도록 얼음에 샘플을 유지합니다. 용해화가 완료된 후, 10, 000g 및 4°C에서 시료를 10분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 펠릿시켜 맑고 어두운 녹색 상신화를 생성합니다.그 후, 이전에 준비된 1.5mm 네이티브 젤의 각 웰에 직접 용해화된 틸라코이드 수퍼네티드 15마이크로리터를 적재합니다. 1X 실행 버퍼를 사용하여 100볼트에서 네이티브 그린 젤을 실행하십시오. 저항 가열을 완화하기 위해 실행 기간 동안 젖은 얼음에 전체 젤 탱크를 배치합니다.젤이 가동을 끝나면 전기 전구에서 제거하고 증류수로 젤 플레이트의 러닝 버퍼를 헹구는 다. 젤에서 상단 플레이트를 제거한 다음 증류수로 젤을 헹구습니다. 여전히 하단 유리 판에 있는 젤을 얼음 위에 놓고 젤을 사용하지 않을 때 플라스틱 랩으로 덮고 어둠 속에서 유지하여 건조하지 않도록 하십시오.다음으로, TCSPC 분석을 진행할 준비가 되면 날카로운 메스 나 면도날을 사용하여 각 관심 있는 대역을 소비합니다. 절제된 밴드에 오염 밴드 재료가 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 분석되는 각 복합체에 대해 형광 분광계를 사용하여 600~800나노미터 사이의 실내 온도 형광 스펙트럼을 만듭니다.슬라이드의 양쪽 끝에 마스킹 테이프를 놓고 여러 번 접을 수 있어 스페이서를 생성하여 슬라이드를 압축하지 않고 단단히 고정한 다음 두 개의 유리 현미경 슬라이드 사이에 젤 슬라이스를 샌드위치할 수 있습니다. 유리 슬라이드 가장자리의 젤 슬라이스에 소량의 물을 추가하여 신호 산란을 줄이는 매끄러운 인터페이스를 만듭니다. 다음으로, 빔이 플레이트의 열린 가장자리를 통해 젤 슬라이스를 공격할 수 있도록 빔 경로에 젤 샌드위치를 고정합니다.각 복합체에 대해 형광 방출 스펙트럼에 걸쳐 일정한 간격으로 총 10, 000 개의 총 데이터 포인트를 수집합니다. 주어진 복합체에 대한 데이터를 분석하려면 먼저 수집된 모든 파장에 대해 각 붕괴 곡선의 피크 높이를 정규화한 다음, 꼬리는 각 붕괴 곡선을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 복합체의 정상 상태 형광 스펙트럼과 일치시킵니다. 녹색 젤 전기 포에이션에 대한 대표적인 결과는 맑고 날카로운 녹색 밴드의 숫자가 표시되는 시금치 틸라코이드의 분석을위한 이상적인 결과의 예를 제공합니다.차선 2와 3은 비그라데이션 5% 아크릴아미드 젤에 간단한 틸라코이드 절연 및 전기전도에서 보다 일반적인 결과를 제시합니다. 차선 4, 5, 6은 틸라코이드 샘플의 수용성 하에서 의 증가된 정도의 증가로 인한 불량한 결과의 예를 제공하며, 7차선은 아라비도시스 틸라코이드가 시금치 대신 사용될 때 달성될 수 있는 결과를 보여줍니다. TCSPC 데이터의 데이터 곡선이 동시에 레지스터로 설정된 후 동일한 피크 높이로 정규화되어 곡선을 데이터의 첫 번째 분석으로 비교할 수 있습니다.그런 다음 서로 다른 복합체의 피크 정규화 된 붕괴 곡선을 지정된 파장에서 서로 겹쳐서 복합체 간의 동작 차이를 시각화 할 수 있습니다. 감쇠 곡선을 일치시키는 꼬리는 부패 관련 스펙트럼을 구성할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, LHCII에 대한 부패 관련 스펙트럼은 동적 기능의 부족과 LHCII 형광 스펙트럼의 모양이 시간이 지남에 따라 신호 붕괴와 동일하게 유지된다는 점에 주목할 만하다.형광 스펙트럼의 붕괴도 지연되어 최대 형광에 도달하기 위해 100 pico초가 필요합니다. 이것은 에너지가 형광부패로 복합체 내의 정력적으로 뚜렷한 안료 사이에서 전달되지 않는다는 것을 건의합니다. 그런 다음 붕괴 관련 스펙트럼은 Band 5 복합체에 대해 구성됩니다.LHCII에 비해 밴드 5의 형광은 훨씬 더 빠르게 부패하여 30 pico초만에 최대 강도에 도달한 다음 500 picoseconds 후 초기 강도의 20 % 미만으로 부패합니다. 이 절차를 시도하는 동안, TCSPC 데이터의 해석은 2 DSDS 페이지와 서부 블로팅 또는 질량 분석에 의해, 예를 들어, 연구 중인 복합체의 구성 요소를 식별하는 추가 생화학 정보에 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Environment

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

연구

환경과학

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

물에 농약의 모니터링을위한 특성화 및 패시브 샘플러의 응용 프로그램

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

대기 에어로졸의 추출 및 계면 활성제의 특성

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

측정 및 토양 침식과 토양 탄산 농도 농업 관리에 관련 된 증 착 패턴 매핑

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

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공장 수용 성 단백질과 소화 탄수화물 콘텐츠를 사용 하 여 옥수수 (지 시 메이 스)를 표본으로 측정

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...