Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Finansiering og støtte ble levert av ved Institutt for kjemi ved Michigan State University.

1. lager løsninger forberedelse til helle innfødt grønne Gels
<ol><li>Forberede en 4 x konsentrert buffer løsning for å løse gels som består av 40% glyserol, 200 mM glysin og 100 mM Tris bufret til pH 8.3.</li>
	<li>Forberede en 4 x konsentrert buffer løsning stabling gels som består av 40% glyserol, 200 mM glysin og 100 mM Tris bufret til pH 6.3.</li>
	<li>Lagre buffere på 4 ° C å hindre vekst av mold. Merk: Bufferne er stabile for måneder på 4 ° C, så utarbeidelse av 100-200 mL hver buffer for fort...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

En vellykket thylakoid solubilization og innfødt gel kjøre vil resultere i oppløsningen av flere forskjellige synlig grønn band på gel uten betydelige forvrengning eller smøre band. Overbelastning gel, høy vaskemiddel konsentrasjon, en feil eksempel pH, fra ikke materiale, kjører gel for fort eller for høy temperatur, og en feil helte gel er alle faktorer som kan bidra til dårlig løst thylakoid komplekser. Mens optimalisere forholdene i gel seg (f.eks., akrylamid gradient konsentrasjoner), kan det hje...

Fotosynteseaktiviteten organismer må justere fysiologi på endrede miljøforhold å maksimere produktiviteten og hell konkurrere med naboer1. Dette er spesielt sant av maskiner som er ansvarlig for lys reaksjoner av fotosyntese, som omgivelseslys forhold kan variere med tre størrelsesordener mellom skygger og fullt sollys. I tillegg kan miljøfaktorer som tørke, kalde eller varmestress redusere tilgjengeligheten av kulldioksyd for karbon fiksering, som er naturlig elektron vasken for produkter av lys reaksjonene. Planter må, derfor høste og utnytte solstråling så effektivt som mulig samtidig beholde muligheten til å spre overflødig lys energi som nødvendig. Mens photooxidative skaden vedvarer rutinemessig under alle lysforhold2,3, manglende evne til å administrere absorbert eksitasjon energi vellykket kan føre til katastrofale celleskader og død. Flere adaptive mekanismer eksisterer at fotosynteseaktiviteten apparatet stilles til endringer i rådende miljøforhold og forbigående svingninger (dvs. over både lange og korte tidsrammer)4. Disse inkluderer langsiktige svar (VTH) og ikke-fotokjemisk slukke (NPQ). NPQ er i seg selv anses å omfatte minst tre andre komponenten fenomener, inkludert staten overganger (qT), raskt induserbart energi slukke (qE) og photoinhibition (qI)5.
Disse prosessene var opprinnelig observert og definert i stor grad i spektroskopiske fenomener [f.eks NPQ refererer til et fall i observerte klorofyll fluorescens (slukke av klorofyll fluorescens) som ikke skyldes en økning i antall fotokjemi]6. Begrepet "staten overganger" tilsvarende refererer til observert endring i relative fluorescens PSI og PSII7. Mens spektroskopiske teknikker som har muliggjort opplisting av disse fenomenene [spesielt puls amplitude modulert (PAM) fluorescens spektroskopi] og fortsette å være en viktig metode for å observere og dissekere fotosynteseaktiviteten prosesser i vivo, mye av biokjemi er nødvendig for å belyse mekanismene bak disse spektroskopiske observasjoner. Staten overganger, for eksempel innebærer en fosforylering/dephosphorylation syklus av LHCII proteiner av STN7 kinase og TAP38/PPH1 fosfatase, henholdsvis8,9,10. Denne syklusen justerer fysisk distribusjon av LHCII antennen mellom de to photosystems ved å flytte en del av LHCII trimers fra PSII til PSI, og dermed endre absorpsjon tverrsnitt av photosystems11,12. QE komponenten NPQ konverterer raskt overflødig eksitasjon energi til varme gjennom handlingene til violaxanthin/zeaxanthin epoxidation/de-epoxidation syklusen og PsbS protein. Den eksakte rollen av PsbS i denne prosessen er ennå ikke fullt ut forstått13. QI komponenten av NPQ, photoinhibition, er vanligvis tilskrevet skader D1 protein av PSII. Restaurering av full fotosynteseaktiviteten kompetanse krever en forseggjort reparasjonsprosessen å reparere skadede PSII photocenters. PSII reparasjonssyklusen innebærer overføring av PSII komplekser av den granal stabler, demontering av komplekser, utskifting av skadet D1 proteiner, sammensetting av PSII komplekser og bevegelse av PSII komplekser tilbake i de granal stabler14. Det eksakte innholdet i photoinhibition og PSII photodamage er fortsatt gjenstand for intens granskning15.
Vanskeligheten i å studere fenomener som staten overganger eller PSII reparasjon oppstår delvis fra det faktum at det er ikke en enkel måte å visualisere mekanikken i komplekse biokjemiske systemer. Den klassiske biokjemiske tilnærmingen å forstå en prosess er å først skille komponentene slik at de kan karakteriseres isolert. Native gel geleelektroforese oppsto fra vellykkede innsats i 1980 å skille og karakterisere photosystem komplekser fra thylakoid membraner med flere skytevåpen metoder (sukrose gradient sentrifugering og kromatografi)16. Vaskemiddel systemer bebygget å forsiktig solubilize innfødte komplekser fra thylakoid membraner ble snart tilpasset electrophoretic separasjon metoder, spesielt ved Allen og Staehelin17 og og Peter og Thornber18, gir opphav Opprinnelig grønn gel geleelektroforese. Mens representerer bare én av en rekke teknikker i eksperimentell arsenal, Opprinnelig side har en rekke attraktive egenskaper som har gjort det mye næringsdrivende metode i fotosyntesen forskning. Opprinnelig side er relativt rask og enkel, krever lite spesialisert utstyr, samtidig som det gir høy oppløsning separasjon av et stort antall thylakoid komplekser samtidig. Dette gjør innfødt siden et praktisk verktøy for å studere thylakoid dynamics og, når kombinert med STANDARDSIDEN i den andre dimensjonen i tillegg til en rekke vaskemiddel og buffer systemer, en allsidig system for å finne og karakterisere nye thylakoid komplekser.
Som blir sagt, har innfødt grønne gels hatt et rykte for å være en upålitelig teknikk, spesielt i uerfarne hender, som det er lett å produsere dårlige resultater bestående av fuzzy, smeary gels med noen band. Dette problemet ble løst, delvis, med innføringen av blue-innfødt side19. Bruk coommassie fargestoff i BN bufferen systemet gjør proteiner mer robust. Derfor BN side er ofte en enklere og mer pålitelig teknikk for en relativ begynner å sette opp og gir høy oppløsning separasjoner av thylakoid komplekser. For disse grunner blitt BN-siden metoden for valg for de fleste i dette feltet. Mens BN-side er vanligvis tregere å kjøre enn grønne gel geleelektroforese, den største ulempen er at den coommassie fargestoffet flekker forstyrrer identifikasjon av svak klorofyll inneholder band, samtidig gjøre nedstrøms spektroskopiske karakterisering problematisk.
Biokjemiske informasjonen gitt av innfødte gels og 2D SDS-side kan være betydelig styrket kombinert med data fra spektroskopiske teknikker. Uavhengig av systemet, et sentralt problem med å bruke native gels for å identifisere komplekser er at identifikasjon kan alltid bli utfordret (dvs. proteinene som finnes i et band kan alltid representere comigrating komplekser eller komponenter, heller enn et enkelt fysiologisk autentisk kompleks). Spektroskopiske karakterisering gir Biofysiske informasjon om pigmenter i grønne gel band og kan brukes til å bestemme hvilke typer komplekser er sannsynlig å inneholde. Klorofyll fluorescens er spesielt nyttig i denne forbindelse på grunn av ofte dramatisk annerledes spectra og fluorescens levetid som er karakteristiske for annet fotosynteseaktiviteten pigment-protein komplekser. Mens enkel stabil 77K fluorescens spectra har historisk vært nyttig i å bekrefte identiteter av innfødt gel komplekser, kan moderne tid-korrelert enkelt Foton teller (TCSPC) gi mye mer informasjon. TCSPC tillater ikke bare karakterisering av komplekser basert på fluorescens levetid, men også gjør mulig den detaljerte beskrivelsen av energi-overføring mellom spectral komponenter i et kompleks. Denne typen karakterisering blir stadig nødvendig som bruk av ulike innfødt gel systemer oppslag og nye antatte komplekser er oppdaget, slik at identifikasjon av protein komplekser godkjennes bedre og gir nye Biofysiske informasjon om hvordan disse kompleksene fungerer.
Denne artikkelen gir vi en metode som gjør at de har liten eller ingen erfaring med innfødt gel geleelektroforese å oppnå høy kvalitet oppløsning av innfødte thylakoid komplekser for å undersøke mekanikken i lys reaksjoner av fotosyntese. Denne grunnleggende teknikken kan bli utvidet til eksperimentator forgodtbefinnende å forbedre resultatene eller utvide anvendelighet til andre arter. Vi beskriver prosessen med å utsette innfødt grønne gel band til TCSPC, samt noen trinn for grunnleggende analyse og presentasjon av dataene fra teknikken. Koblingen av innfødte gel geleelektroforese med TCSPC analyse utvider nytten av disse gel systemer ved hjelp av godkjenning og Biofysiske karakterisering av protein komplekser i bandene. Grønne gel systemet beskrevet her er basert på det utviklet av Allen og Staehelin17 med noen modifikasjoner og er den samme som brukes i Schwarz et al. 20. dette systemet er en av mange, men har bestemte funksjoner som er nyttige for denne metoden. Det er rask nok slik at thylakoid isolasjon, gel geleelektroforese og TCSPC analyse praktisk kan utføres på en dag, obviating potensielle problemer med eksempel lagring og fornedrelse. Vi finner også at denne metoden er robust i hendene på uerfarne brukere, samtidig som den gir resultater som spenner fra god til overlegen, avhengig av graden av optimalisering.
Det er viktig å huske på at komplekser visualisert på en innfødt gel avhenger både vaskemiddel og buffer systemer brukes samt biologi av organismen under etterforskning. Forskjellige vaskemiddel og buffer systemer skille fortrinnsvis ulike typer komplekser, og en gitt fotosynteseaktiviteten organisme har forskjellige komplekser fra andre organismer, ikke alle som vil være tilstede under noen gitt omstendighet. Systemet er beskrevet her er spesielt egnet til studiet av PSI megacomplexes, som beskrevet i Schwarz et al. 20, men det faller på mer destabiliserende enden av spekteret for de som studerer PSII megacomplexes. For en omfattende studie av ulike vaskemiddel og buffer i native gel geleelektroforese thylakoid proteiner, anbefales det å gjennomgå Järvi et al. 21 og Rantala et al. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

Lys reaksjoner av fotosyntesen er utført av en rekke pigmentert protein kompleks i thylakoid membraner. Den støkiometri og organisering av disse kompleksene er svært dynamisk både lange og korte tidsskalaer grunnet prosesser som tilpasse fotosyntese på endrede miljøforhold (dvs. ikke-fotokjemisk slukke, staten overganger, og langsiktige svar). Historisk disse prosessene er beskrevet tyske i forhold til endringer i klorofyll fluorescens og spektroskopi er en viktig metode for å overvåke fotosynteseaktiviteten parametere. Det er et begrenset antall måter som underliggende protein kompleks dynamikken kan visualiseres. Her beskriver vi en rask og enkel metode for høyoppløselig separasjon og visualisering av thylakoid komplekser, innfødt grønne gel geleelektroforese. Denne metoden er kombinert med tid-korrelert enkelt Foton teller for detaljert karakterisering av klorofyll fluorescens egenskapene band atskilt på grønne gel.

Representant resultater for grønne gel geleelektroforese presenteres i figur 1. Lane 1 gir et eksempel ideell resultater for grønne gel geleelektroforese av spinat thylakoids, der et maksimalt antall klare, skarpe grønn band er synlige. Disse resultatene er litt atypiske, delvis fordi ikke alle feltene i lane 1 er normalt finnes i et gitt utvalg. Flere eksempler opprydding, i form av chloroplast isolasjon før thylakoid solubilization og gradient gel gelee...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Her presenterer vi en protokoll for å skille solubilized thylakoid komplekser av innfødte Green Gel geleelektroforese. Grunnleggende trinn for dataanalyse tilbys og grønne gel band er senere preget av tid korrelert enkelt Foton teller (TCSPC).

Separasjon av spinat Thylakoid Protein komplekser av innfødte Green Gel gelelektroforese og Band karakterisering ved hjelp Time-Correlated enkelt Foton teller

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Denne metoden er nyttig for å svare på visse viktige spørsmål innen fotosynteseforskning som er antatte thylakoidkomplekser fysiologisk reelle komplekser med energisk tilkoblede komponenter? Den største fordelen med den grønne gel- og TCSPC-protokollen som er beskrevet her, er at den er rask og robust. Prøver kan enkelt behandles og analyseres på en enkelt dag, noe som gjør problemer med lagring og stabilitet mindre av en bekymring.Selv om TCSPC kan gi innsikt i de fotosyntetiske systemene vi har studert her, kan det også brukes på andre systemer som spenner fra kjemiske til fysiske og biologiske som studier av fluorescerende molekylær bevegelse i væsker, celler eller roman-strukturelle motiver som monomolekylære lag og ioniske væsker. For å starte denne prosedyren, klargjør de nødvendige lagerløsningene og grønne minigelene som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter får du litt is og demper lysene.Ved hjelp av et glass Dounce homogenisator, helt homogenisere spinat bladene i omtrent en til to milliliter TMK buffer. For å lage en enkel filtreringsenhet, kutt en delikat oppgavesletting i to og brett den i kvartaler. Fjern stempelet fra en sprøyte, og pakk deretter den brettede oppgaven tørkes inn i bunnen av sprøyten.Pipette bladet homogenere inn i midten av oppgave-tørk filteret, deretter bruke stempelet til å passere homogenatet gjennom filteret og samle den i en 1,5-milliliter sentrifuge rør. Sentrifuger homogenatet ved 5, 000 g og fire grader Celsius i 10 minutter for å pellet det uoppløselige materialet, inkludert thylakoidmembranene. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i en milliliter TMK buffer.For å trekke ut klorofyll fra hver prøve, ta en 50-mikroliter aliquot og overfør den til et 1,5-milliliter mikrocentrifugerør. Tilsett 950 mikroliter metanol, hette røret, og bland ved å invertere det flere ganger. Sentrifuge ved 10.000 g i 10 minutter for å pellet de utfelte proteinene.Bruk klorofyllkonsentrasjonsmålingene som en veiledning, fjern og kast noe volum fra hver prøve etter behov til hvert rør inneholder samme totale mengde klorofyll. Sentrifuge ved 5000 g i 10 minutter for å re-pellet thylakoid membranene. Fjern og kast det overnaturlige, vær forsiktig med å fjerne alle de supernatante uten å forstyrre pelleten.Først tine en aliquot av TMK 30% glyserol vaskemiddel løsning. Inverter flere ganger for å blande og holde løsningen på is. Tilsett et passende volum av vaskemiddeloppløsningen for å oppløse pelleten og resultere i en endelig klorofyllkonsentrasjon på ett mg per milliliter.Pipetten opp og ned gjentatte ganger mens du er forsiktig med å unngå skummende i prøven. Deretter holder du prøven på is for å tillate thylakoid prøver å løse. Etter at solubiliseringen er fullført, sentrifuger prøven ved 10, 000 g og fire grader Celsius i 10 minutter for å pellet det uoppløselige materialet, noe som resulterer i en klar, mørk grønn supernatant.Etter dette laster du 15 mikroliter av solubilisert tyrolakoid supernatant direkte på hver brønn av en tidligere forberedt 1,5-millimeter innfødt gel. Bruk 1X løpebuffer, begynn å kjøre den innfødte grønne gelen på 100 volt. Plasser hele geltanken på våt is i løpet av løpet for å redusere resistiv oppvarming.Når gelen er ferdig med å gå, fjern den fra elektroforesecellen og skyll løpebufferen av gelplatene med destillert vann. Fjern topplaten fra gelen og skyll deretter gelen med destillert vann. Plasser gelen, som fortsatt er på bunnglassplaten, på is;når gelen ikke er i bruk, dekk den med plastfolie og hold den i mørket for å hindre at den tørker ut.Deretter bruker du en skarp skalpell eller barberblad for å avgifte hvert interessebånd når du er klar til å fortsette med TCSPC-analysen. Pass på at det utskåret båndet ikke inneholder forurensende båndmateriale. For hvert kompleks som analyseres, bruk et fluorescerende spektrometer for å lage et romtemperatur fluorescerende spektrum mellom 600 og 800 nanometer.Plasser maskeringstape på hver ende av lysbildene og brett den over flere ganger for å lage avstandsslysere, noe som gjør at lysbildene kan holdes sammen fast uten å komprimere mellomrommet mellom, og smør deretter gelskiven mellom to glassmikroskopisklier. Tilsett en liten mengde vann til gelskiven på kanten av glassskliene for å skape et jevnt grensesnitt som vil redusere signalspranging. Deretter klemmer du gelsmørbrødet i strålebanen slik at strålen treffer gelskiven gjennom den åpne kanten av platene.For hvert kompleks samler du inn 10 000 totale datapunkter med jevne mellomrom på tvers av fluorescensutslippsspekteret. For å analysere dataene for et gitt kompleks, normaliser først topphøyden på hver forfallskurve for alle bølgelengdene som samles inn, og deretter hale matcher hver forfallskurve til steady state fluorescence spekteret av komplekset som beskrevet i tekstprotokollen. Representative resultater for grønn gelelektroforese gir et eksempel på et ideelt resultat for analyse av spinat thylakoids, hvor en rekke klare, skarpe grønne bånd er synlige.Kjørefelt 2 og 3 presenterer mer typiske resultater fra enkel thylakoid isolasjon og elektroforese på en ikke-gradient 5% akrylamidgel. Kjørefelt 4, 5 og 6 gir et eksempel på dårlige resultater på grunn av økende grad av under solubilisering av thylakoid-prøven, mens kjørefelt 7 viser resultatene som kan oppnås når Arabidopsis thylakoider brukes i stedet for spinat. Når datakurvene for TCSPC-dataene er satt til samme tidsregister, kan de normaliseres til samme topphøyde, noe som gjør at kurvene kan sammenlignes som en første analyse av dataene.Topp-normaliserte forfallkurver fra forskjellige komplekser kan deretter legges over med hverandre ved en gitt bølgelengde, slik at forskjellene i atferd mellom kompleksene kan visualiseres. Tail matchende forfall kurver gjør det mulig for bygging av forfall-assosiert spektra. Som sett her, er den forfallsrelaterte spektra for LHCII kjent for mangelen på dynamiske funksjoner, og formen på LHCII fluorescensspekteret forblir den samme som signalforfall over tid.Forfallet av fluorescensspekteret er også forsinket, noe som krever 100 picosekunder for å nå maksimal fluorescens. Dette tyder på at energi ikke overføres mellom energisk distinkte pigmenter i komplekset som fluorescens forfaller. Den forfallsrelaterte spektraen bygges deretter for Band 5-komplekset.Sammenlignet med LHCII forfaller fluorescensen fra Band 5 mye raskere, og når maksimal intensitet i bare 30 picosekunder og deretter forfaller til mindre enn 20% av den opprinnelige intensiteten etter 500 picosekunder. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at tolkning av TCSPC-dataene vil stole på ytterligere biokjemisk informasjon som identifiserer komponentene i kompleksene som studeres, for eksempel av 2 DSDS-PAGE og Western Blotting eller massespektrometri.

Research

JoVE Journal

Environment

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimalisert negativ farging: en High-throughput Protokoll for Undersøke Liten og Asymmetric Protein struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automatisert Gel Størrelse Selection å forbedre kvaliteten på Neste-generasjons Sekvense Biblioteker Forberedt fra miljø vannprøver

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Karakterisering og anvendelse av passive prøvetakere for overvåking av plantevernmidler i vann

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Ekstraksjon og karakterisering av overflateaktive midler fra atmosfære Aerosoler

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måle og kartlegge jorderosjon og deponering relatert til jord Carbonate konsentrasjoner Under landbruks forvaltningen

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Innsamling og utvinning av yrkesmessig Air prøver for analyse av sopp DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Karakteristikk av akvatiske biofilm med flowcytometri

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Kvantifisere anlegget løselig Protein og fordøyelige karbohydrater innhold, bruke korn (Zea mays) som en Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Påvisning av Tilapia Lake Virus bruker konvensjonelle RT PCR og SYBR grønne RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...