Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
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Financiamento e apoio foram fornecidos pelo departamento de química da Universidade de estado de Michigan.

1. as soluções preparação para despejar géis verdes nativas
<ol><li>Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para a resolução de géis, consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 8.3.</li>
	<li>Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para empilhamento géis consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 6.3.</li>
	<li>Armazene esses buffers a 4 ° C para evitar o crescimento de mofo. Nota: Os buffers são estáveis por meses ...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. 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L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

Um nativo gel executar e solubilização de tilacoides bem sucedida resultará na resolução de várias bandas de verdes visíveis distintas sobre o gel sem distorção significativa ou manchas das bandas. Sobrecarga do gel, uma alta concentração de detergente, um pH de amostra incorreta, não dissolvido material, executando o gel muito rapidamente ou a uma temperatura muito alta, e um gel impropriamente derramado são todos os fatores que podem contribuir para complexos de tilacoides mal resolvido. Otimizar as condi?...

Organismos fotossintéticos constantemente devem ajustar sua fisiologia para mudanças nas condições ambientais para maximizar sua produtividade e competir com sucesso com os vizinhos,1. Isto é especialmente verdadeiro para a maquinaria responsável para as reações de luz da fotossíntese, como luz ambiente condições podem flutuar por três ordens de magnitude entre as sombras e a luz do sol. Além disso, fatores ambientais como estresse de calor, frio ou seca podem reduzir a disponibilidade de dióxido de carbono para a fixação de carbono, que é o coletor de elétrons naturais para os produtos das reações luz. Plantas devem, portanto, colher e utilizar radiação solar de forma mais eficiente possível, mantendo a capacidade de dissipar a energia da luz em excesso, se necessário. Enquanto photooxidative dano ainda ocorre rotineiramente sob todas as condições de luz2,3, falha para gerenciar a energia absorvida da excitação com êxito pode levar a célula catastrófico dano e morte. Vários mecanismos adaptativos existem que permitem que o aparato fotossintético a ser afinado para mudanças nas condições ambientais prevalecentes e flutuações transiente (ou seja, em escalas de tempo longas e curtas)4. Estes incluem a resposta a longo prazo (LTR) e não-fotoquímica têmpera (NPQ). NPQ é considerado para abranger pelo menos três outros fenômenos de componente, incluindo transições de estado (qT), energia rapidamente inducible têmpera (qE) e Fotoinibição (qI)5.
Estes processos foram originalmente observados e definidos em grande parte em termos de fenômenos espectroscópicos [por exemplo, NPQ refere-se a uma gota na fluorescência de clorofila observados (têmpera da fluorescência da clorofila) que não é devido a um aumento da taxa de fotoquímica]6. O termo "transições de estado" da mesma forma se refere a mudança observada no montante relativo de fluorescência da PSI e do FSII7. Enquanto as técnicas espectroscópicas que tornaram possível a enumeração destes fenómenos [em particular, amplitude de pulso modulada espectroscopia de fluorescência (PAM)] e continuar a ser um meio vital para a observação e dissecando processos fotossintéticos em vivo, uma grande quantidade de bioquímica é necessário para elucidar os mecanismos subjacentes a estas observações espectroscópicas. Transições de estado, por exemplo, envolve um ciclo de fosforilação/desfosforilação de proteínas LHCII pelo STN7 quinase e fosfatase TAP38/PPH1, respectivamente,8,9,10. Este ciclo ajusta a distribuição física da antena LHCII entre as dois fotossistemas movendo uma porção de trímeros LHCII do FSII para PSI, alterando assim a absorção de secção transversal dos fotossistemas11,12. O componente qE de NPQ rapidamente converte energia de excesso de excitação em calor através das acções do ciclo de epoxidação/de-epoxidação violaxantina/zeaxantina e a proteína PsbS. O papel exato do PsbS neste processo é que ainda não foi totalmente compreendido13. O componente de qI de NPQ, Fotoinibição, é geralmente atribuído a danos à proteína D1 do FSII. Restauração de competência total fotossintética requer um processo de reparação elaborado para corrigir danificados do FSII photocenters. O ciclo de reparação do FSII envolve a migração de complexos do FSII fora as pilhas granal, desmantelamento dos complexos, substituição de proteínas danificadas de D1, remontagem dos complexos do FSII e movimento de complexos do FSII volta para as pilhas granal14. A natureza exata do Fotoinibição e do FSII Fotodano continua a ser um objecto de intenso escrutínio15.
A dificuldade em estudar fenómenos como o estado faz a transição ou reparação do FSII surge, em parte, do fato de que há não uma maneira simples de visualizar a mecânica de sistemas bioquímicos complexos. A abordagem clássica de bioquímica para o entendimento de um processo é primeiro separar seus componentes para que eles podem ser caracterizados em isolamento. Eletroforese em gel de nativo surgiu de esforços bem sucedidos na década de 1980 para separar e caracterizar os complexos de fotossistema de membranas tilacoides com mais métodos preparativa (centrifugação gradiente de sacarose e cromatografia)16. Os detergentes sistemas desenvolvidos para solubilizar suavemente os complexos nativos de membranas tilacoides logo foram adaptados para métodos de separação eletroforética, mais notavelmente por Allen e Staehelin17 e e Pedro e Thornber18, dando origem a eletroforese em gel verde nativo. Enquanto representando apenas um fora de uma variedade de técnicas no arsenal experimental, nativo de página tem um número de características atraentes que a tornaram um método muito utilizado em pesquisas de fotossíntese. PÁGINA nativa é relativamente rápido e simples, que requerem equipamento pouco especializado, proporcionando simultaneamente uma separação de alta resolução de um grande número de complexos de tilacoides. Isso faz o nativa página uma ferramenta conveniente para estudar a dinâmica de tilacoides e, quando combinado com página padrão na segunda dimensão, bem como uma variedade de sistemas tampão e detergente, um sistema versátil para localizar e caracterizar novos complexos de tilacoides.
Dito isso, géis verdes nativos teve uma reputação de ser uma técnica não-confiável, especialmente em mãos inexperientes, como é fácil produzir maus resultados consistindo de géis fuzzy, manchadas com poucas bandas. Este problema foi resolvido, em parte, com a introdução do azul-nativo página19. O uso de tintura de coommassie no sistema de reserva BN faz separação de proteína mais robusto. Portanto, BN-página é frequentemente uma técnica mais fácil e mais confiável para um novato relativo para configurar e pode fornecer separações de alta resolução de complexos de tilacoides. Por estas razões, BN-página tornou-se o método de escolha para a maior parte do trabalho deste campo. Enquanto BN-PAGE é geralmente mais lento funcionar do que a electroforese do gel verde, sua principal desvantagem é que a coloração de tintura coommassie interfere com a identificação das bandas fracas contendo clorofila, respeitando também a jusante espectroscópicas caracterização problemática.
Fornecer as informações bioquímicas géis nativos e SDS-PAGE 2D pode ser grandemente reforçada quando combinados com dados de técnicas espectroscópicas. Independentemente do sistema utilizado, com o uso de géis nativos para identificar complexos, um problema central é que a identificação sempre pode ser contestada (i.e., as proteínas encontradas em uma banda poderia sempre representam comigrating complexos ou componentes, prefiro do que um complexo único fisiologicamente autêntico). Caracterização espectroscópica fornece informações biofísicas sobre os pigmentos nas bandas de gel verde e pode ser usada para determinar quais tipos de complexos são susceptíveis de conter. Fluorescência da clorofila é especialmente útil a este respeito devido ao frequentemente dramàtica diferentes espectros e vidas de fluorescência que são característicos de complexos diferentes pigmentos fotossintéticos-proteína. Enquanto os espectros de fluorescência simples estado estacionário 77K têm sido historicamente útil em confirmar as identidades dos complexos de gel de nativo, moderno tempo-correlacionados fotão contando (TCSPC) pode fornecer muito mais informações. TCSPC permite não só a caracterização dos complexos com base no tempo de vida de fluorescência, mas também torna possível a descrição detalhada de transferência de energia entre os componentes espectrais dentro de um complexo. Este tipo de caracterização está se tornando cada vez mais necessário, como o uso de várias páginas espelhadas de sistemas gel nativo e novos complexos putativos são descobertos, permitindo a identificação de complexos de proteínas para melhor ser autenticado e fornecendo novos biofísicas informações sobre como funcionam estes complexos.
Neste artigo, nós fornecemos um método que permite que aqueles que têm pouca ou nenhuma experiência com eletroforese em gel de nativo para obter uma resolução de alta qualidade de complexos de tilacoides nativa com a finalidade de investigar a mecânica das reações de luz fotossíntese. Esta técnica básica então pode ser aumentada a critério do experimentador para melhorar os resultados ou estender a aplicabilidade de outras espécies. Em seguida descrevemos o processo para submeter gel verde nativo bandas TCSPC, bem como algumas etapas para análise básica e apresentação dos dados fornecidos pela técnica. O acoplamento da electroforese do gel de nativo com análise TCSPC estende a utilidade destes sistemas de gel, fornecendo autenticação e biofísica caracterização de complexos de proteínas dentro das bandas. O sistema do gel verde aqui descrito se baseia que desenvolvido por Allen e Staehelin17 com algumas modificações e é o mesmo usado em Schwarz et al. 20. este sistema é um dos muitos, mas tem características específicas que são úteis para esta metodologia. É rápida o suficiente para que o isolamento de tilacoides, eletroforese em gel e análise TCSPC conveniente podem ser realizadas em um dia, prevenindo possíveis problemas de degradação e armazenamento de amostra. Encontramos, também, que este método é robusto nas mãos de usuários inexperientes, enquanto continua a fornecer resultados que variam de boa a superior, dependendo do grau de otimização.
É importante ter em mente que os complexos visualizados em um gel nativo dependem sobre o detergente e o buffer de sistemas utilizados, bem como sobre a biologia do organismo sob investigação. Sistemas diferentes de detergente e buffer preferencialmente separam os diferentes tipos de complexos, e um determinado organismo fotossintético terá diferentes complexos de outros organismos, não os quais estarão presentes sob qualquer circunstância. O sistema descrito aqui é particularmente adequado para o estudo da PSI megacomplexes, conforme descrito em Schwarz et al. 20, mas cai na extremidade mais desestabilizador do espectro para quem está estudando megacomplexes do FSII. Para um estudo abrangente dos diversos sistemas de detergente e tampão usada em eletroforese em gel nativa das proteínas de tilacoides, é aconselhável rever Järvi et al. 21 e Rantala et al 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

As reações de luz da fotossíntese são realizadas por uma série de complexos de proteínas pigmentadas nas membranas tilacoides. A estequiometria e organização destes complexos é altamente dinâmico no longo e escalas de tempo curto devido a processos que se adaptam a fotossíntese para mudanças nas condições ambientais (ou seja, não-fotoquímica têmpera, transições de estado e o resposta a longo prazo). Historicamente, estes processos têm sido descritos espectroscopicamente em termos de mudanças na fluorescência da clorofila, e espectroscopia continua a ser um método vital para o monitoramento de parâmetros fotossintéticos. Há um número limitado de maneiras em que a subjacente dinâmica complexa de proteínas pode ser visualizada. Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para a separação de alta resolução e visualização dos tilacoides complexos, eletroforese em gel verde nativo. Este método é acoplado com tempo-correlacionados fotão contando para caracterização detalhada das propriedades de fluorescência da clorofila das bandas separadas no gel verde.

Resultados representativos para a electroforese do gel verde são apresentados na Figura 1. Pista 1 fornece um exemplo de resultados ideais para eletroforese em gel verde de espinafre contém, em que um número máximo de faixas verdes claras e nítidas é visível. Estes resultados são um pouco atípicos, em parte porque não todas as bandas que vi na pista 1 estão normalmente presentes em uma determinada amostra. Limpeza da amostra adicional, sob a forma ...

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Aqui nós apresentamos um protocolo para complexos de tilacoides solubilizado, separadas por eletroforese em Gel de verde nativo. Bandas de gel verde posteriormente são caracterizadas por tempo correlacionados Single Photon contagem (TCSPC) e etapas básicas para análise de dados são fornecidas.

Separação de espinafre tilacoides complexos de proteínas por eletroforese em Gel verde nativo e caracterização de banda usando contagem de fóton único Time-Correlated

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Este método é útil para responder a certas perguntas-chave no campo da pesquisa da fotossíntese, como se os complexos putakoóides fisiologicamente reais com componentes energeticamente conectados? A principal vantagem do gel verde e do protocolo TCSPC descrito aqui é que ele é rápido e robusto. As amostras podem ser facilmente processadas e analisadas em um único dia, tornando as questões de armazenamento e estabilidade menos preocupantes.Embora o TCSPC possa fornecer informações sobre os sistemas fotossintéticos que estudamos aqui, ele também pode ser aplicado a outros sistemas que vão desde químicos até físicos e biológicos, como estudos de movimento molecular fluorescente em líquidos, células ou motivos estruturais novos, como camadas monomoleculares e líquidos iônicos. Para iniciar este procedimento, prepare as soluções de estoque necessárias e mini géis verdes conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, obtenha um pouco de gelo e apague as luzes.Usando um homogeneizador do Dounce de vidro, homogeneize completamente as folhas de espinafre em aproximadamente um a dois mililitros de tampão TMK. Para criar um simples dispositivo de filtragem, corte uma tarefa delicada ao meio e dobre-a em trimestres. Remova o êmbolo de uma seringa e, em seguida, embale a tarefa dobrada limpe na parte inferior da seringa.Pipetar a folha homogeneizar-se no centro do filtro de limpeza de tarefas, em seguida, use o êmbolo para passar o homogeneizar através do filtro e colecioná-lo em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar o homogeneizar a 5.000 g e quatro graus Celsius por 10 minutos para pelotar o material insolúvel, incluindo as membranas de tirokoide. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em um mililitro de tampão TMK.Para extrair clorofila de cada amostra, pegue uma alíquota de 50 microliter e transfira-a para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 950 microliters de metanol, tampa o tubo e misture invertendo-o várias vezes. Centrifugar a 10.000 g por 10 minutos para pelotar as proteínas precipitadas.Utilizando as medidas de concentração de clorofila como guia, remova e descarte algum volume de cada amostra conforme necessário até que cada tubo contenha a mesma quantidade total de clorofila. Centrifugar a 5.000 g por 10 minutos para re-pelotar as membranas de tirokoóide. Remova e descarte o supernasce, tomando cuidado para remover todo o supernatante sem perturbar a pelota.Primeiro, descongele uma alíquota de solução de detergente TMK 30%glicerol. Inverta várias vezes para misturar e manter a solução no gelo. Adicione um volume apropriado da solução de detergente para dissolver a pelota e resultar em uma concentração final de clorofila de um miligrama por mililitro.Pipeta para cima e para baixo repetidamente enquanto é cuidadoso para evitar espumar na amostra. Em seguida, mantenha a amostra no gelo para permitir que as amostras de tiroakoide solubilizem. Após a solubilização completa, centrifugar a amostra a 10.000 g e quatro graus Celsius por 10 minutos para pelotar o material insolúvel, resultando em um supernatante verde claro e escuro.Depois disso, carregue 15 microliters de supernanato de tirokoide solubilizado diretamente em cada poço de um gel nativo de 1,5 milímetros previamente preparado. Usando tampão de corrida 1X, comece a executar o gel verde nativo a 100 volts. Coloque todo o tanque de gel em gelo molhado durante a corrida para mitigar o aquecimento resistivo.Quando o gel terminar de funcionar, remova-o da célula de eletroforese e enxágue o tampão de corrida das placas de gel com água destilada. Retire a placa superior do gel e enxágue o gel com água destilada. Coloque o gel, que ainda está na placa de vidro inferior, no gelo;quando o gel não estiver em uso, cubra-o com plástico e mantenha-o no escuro para evitar que ele seque.Em seguida, use um bisturi afiado ou lâmina de barbear para extirpar cada faixa de interesse quando estiver pronto para prosseguir com a análise TCSPC. Certifique-se de que a banda excised não contém material de banda contaminante. Para cada complexo analisado, use um espectrômetro fluorescente para fazer um espectro fluorescente de temperatura ambiente entre 600 e 800 nanômetros.Coloque fita adesiva em cada extremidade dos slides e dobre-a várias vezes para criar espaçadores, o que permitirá que os slides sejam mantidos juntos firmemente sem comprimir o espaço entre eles, em seguida, sanduíche a fatia de gel entre dois slides de microscopia de vidro. Adicione uma pequena quantidade de água à fatia de gel na borda dos slides de vidro para criar uma interface lisa que reduzirá a dispersão de sinais. Em seguida, aperte o sanduíche de gel no caminho do feixe para que o feixe atinja a fatia de gel através da borda aberta das placas.Para cada complexo, colete 10.000 pontos de dados totais em intervalos regulares em todo o espectro de emissões de fluorescência. Para analisar os dados para um determinado complexo, primeiro normalizar a altura máxima de cada curva de decomposição para todos os comprimentos de onda coletados, em seguida, a cauda corresponde a cada curva de decaimento ao espectro de fluorescência de estado constante do complexo, conforme descrito no protocolo de texto. Resultados representativos para a eletroforese de gel verde fornecem um exemplo de um resultado ideal para a análise de timilarias de espinafre, onde uma série de faixas verdes claras e afiadas são visíveis.As faixas 2 e 3 apresentam resultados mais típicos do simples isolamento da tireilaboida e da eletroforese em um gel de acrilamida não gradiente de 5%. As faixas 4, 5 e 6 fornecem um exemplo de resultados ruins devido ao aumento dos graus de solubilização da amostra de tirokoide, enquanto a faixa 7 demonstra os resultados que podem ser alcançados quando os tiroxilarias arabidopsis são usados em vez de espinafre. Depois que as curvas de dados dos dados do TCSPC foram definidas para o mesmo registro de tempo, elas podem ser normalizadas para a mesma altura máxima, o que permite que as curvas sejam comparadas como uma primeira análise dos dados.Curvas de decadência normalizadas de diferentes complexos podem então ser sobrepostas umas com as outras em um determinado comprimento de onda, permitindo que as diferenças de comportamento entre os complexos sejam visualizadas. A cauda que corresponde às curvas de decomposição permite a construção de espectros associados à decomposição. Como visto aqui, o espectro associado à decadência para o LHCII é notável pela falta de recursos dinâmicos e a forma do espectro de fluorescência LHCII permanece a mesma que o sinal decai ao longo do tempo.A decomposição do espectro da fluorescência também está atrasada, exigindo 100 picosegundos para atingir a fluorescência máxima. Isso sugere que a energia não é transferida entre pigmentos energeticamente distintos dentro do complexo à medida que a fluorescência decai. O espectro associado à decadência é então construído para o complexo da Banda 5.Em comparação com o LHCII, a fluorescência da Banda 5 decai muito mais rapidamente, atingindo intensidade máxima em apenas 30 picosegundos e, em seguida, decading para menos de 20% da intensidade inicial após 500 picosegundos. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que a interpretação dos dados do TCSPC dependerá de informações bioquímicas adicionais que identifiquem os componentes dos complexos em estudo, por exemplo, por 2 DSDS-PAGE e Western Blotting ou espectrometria de massa.

Research

JoVE Journal

Environment

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Ambiente

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