Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Финансирование и поддержка были предоставлены Департаментом химии в университете штата Мичиган.

1. штока решения подготовка для наливания родной зеленый гели
<ol><li>Подготовьте 4 x концентрированной буферный раствор для разрешения гели, состоящий из 40% глицерина, глицин 200 мм и 100 мм трис-буфер с рН 8.3.</li>
	<li>Подготовьте 4 x концентрированной буферный раствор для укладки гели, состоящий ?...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

Успешный тилакоидов солюбилизация и родной гель запустить приведет к резолюции несколько отдельных видны зеленые полос на гель без существенных искажений или мазать полос. Перегрузка гель, высокой концентрации моющего средства, неправильный пример рН, сжимающих материал, управление?...

Фотосинтетические организмы должны постоянно корректировать их физиологии изменения экологических условий, чтобы максимизировать их производительность и успешно конкурировать с соседями1. Это особенно верно в отношении механизма, ответственного за свет реакции фотосинтеза, как освещенности условия может колебаться на трех порядков между тенями и полного солнечного света. Кроме того экологические факторы, такие, как засухи, холода или тепла стресс может уменьшить наличие углекислого газа для фиксации углерода, который является естественным электрона раковина для продуктов реакций света. Растения должны, таким образом, урожай и максимально эффективно использовать солнечной радиации при сохранении способности рассеивать избыток энергии света при необходимости. В то время как фотоокислительного ущерб по-прежнему происходит регулярно в всех условиях освещения2,3, неспособность управлять энергии поглощается возбуждения успешно может привести к катастрофическим клеток от повреждения и смерти. Существует несколько адаптивной механизмов, которые позволяют фотосинтетического аппарата быть настроены как изменения в существующих экологических условий, так и временные колебания (т.е., более длинные и короткие сроки)4. К ним относятся долгосрочный ответ (LTR) и не фотохимического тушения (ЕНОЛ). ЕНОЛ само по себе считается охватывать по крайней мере три других компонента явлений, включая переходы состояний (qT), быстро индуцибельной энергии закалочные (qE) и фотоингибированию (Ци)5.
Эти процессы были первоначально наблюдается и во многом определяется спектроскопических явления [например, ЕНОЛ относится к падению в наблюдаемых хлорофилловое свечение (тушения флуоресценции хлорофилла), это не за счет увеличения темпов Фотохимия]6. Термин «переходы состояния» аналогичным образом относится к наблюдаемые изменения в относительное количество флуоресцирования из PSI и PSII7. В то время как спектральные методы, которые сделали возможным перечисление этих явлений [в частности, амплитуда импульса модулируется отдела Флуоресценция (PAM)] и продолжают оставаться жизненно важным средством для наблюдения и рассекает фотосинтетических процессов в VIVO, немало биохимии необходима для выяснения механизмов, лежащих в основе этих спектроскопических наблюдений. Состояниями, например, включает в себя цикл фосфорилирования/дефосфорилирования белков LHCII STN7 киназы и фосфатазы TAP38/PPH1, соответственно8,9,10. Этот цикл регулирует физическое распределение LHCII антенны между двух фотосистем, перемещая часть тримеры LHCII от PSII к PSI, изменив таким образом поглощение сечения фотосистемы11,12. QE компонент ЕНОЛ быстро преобразует энергию избыток возбуждения в тепла через действия виолаксантина/зеаксантин эпоксидирования/деэпоксидации цикла и ОВО белка. Точная роль ОВО в этом процессе является еще не полностью понимает13. Обычно компонент Ци ЕНОЛ, фотоингибированию, приписывается повреждения D1 белок PSII. Восстановление полной фотосинтетической компетенции требует сложный ремонт процесс исправить поврежденные PSII photocenters. PSII ремонт цикл включает миграцию PSII комплексов из granal стеки, демонтаж комплексов, замена поврежденных D1 белков, сборка PSII комплексов и движение PSII комплексов обратно в granal стеки14. Точный характер фотоингибированию и PSII фотоповреждения остается предметом пристального внимания15.
Трудность в изучении явлений как государство переходы или PSII ремонт частично обусловлена тем фактом, что существует не один простой способ визуализации механики сложных биохимических систем. Классический биохимических подход к пониманию процесса является сначала отделить его компонентов, так что они могут быть охарактеризованы в изоляции. Родной гель-электрофорез возникло от успешных усилий в 1980-х для разделения и характеризуют комплексы фотосистем от тилакоидной мембраны с более препаративные методы (а именно сахароза градиентного центрифугирования и хроматография)16. Моющих систем, разработанных для нежно солюбилизировать последнего родной комплексы из тилакоидных мембранах вскоре были адаптированы для электрофоретического разделения методы, прежде всего, Аллен и Штелин17 и и Петра и Thornber18, рождая электрофорез геля для родной зеленый. В то время как представляющих только один из различных методов экспериментальной арсенала, родной страница имеет ряд привлекательных характеристик, которые сделали его метод широко занятых в исследованиях фотосинтеза. Собственные страницы относительно быстро и просто, требующих мало специализированное оборудование, обеспечивая высокое разрешение разделение большого числа тилакоидов комплексов одновременно. Это делает родной страница удобным инструментом для изучения динамики тилакоидов и, в сочетании со стандартной страницы второго измерения, а также разнообразные системы моющего средства и буфера, универсальная система для поиска и характеристике новых комплексов тилакоидов.
Это, как говорится, родной зеленый гели имели репутацию ненадежного техники, особенно в неопытных руках, как это легко производить плохие результаты, состоящий из нечеткой, замазанных текстов гели с несколько полос. Эта проблема была решена, в частности, с введением сине родной страница19. Использование красителя coommassie в системе буфер BN делает разделение белков более надежным. Таким образом BN-страница часто проще и надежнее техника для относительного новичка настроить и может обеспечить высоким разрешением цветоделение тилакоидов комплексов. По этим причинам BN-страница стал методом выбора для большинства работы этого поля. В то время как BN-страница обычно медленнее, для запуска, чем зеленый гель-электрофорез, его основным недостатком является то, что coommassie краски для окрашивания вмешивается идентификации слабый хлорофилл содержащих полос, а также ниже по течению спектральные характеристика проблематичным.
Биохимические информация, предоставленная родной гели и 2D SDS-PAGE может быть значительно укреплен, в сочетании с данными от спектроскопических методов. Независимо от системы работают, Центральная проблема с использованием родного гели для выявления комплексов является, что идентификация всегда может быть оспорено (т.е., белки найти в группе может всегда представляют comigrating комплексов или компоненты, скорее чем одно физиологически аутентичные комплекс). Спектральные характеристики обеспечивает биофизической информации о пигментах в полосы зеленого геля и может использоваться для определения, какие типы комплексов они могут содержать. Хлорофилловое свечение является особенно полезным в этом отношении из-за часто резко различных спектров и флуоресценции продолжительностей жизни, которые характерны для различных фотосинтетический пигмент белковых комплексов. В то время как простой установившемся 77K спектры флуоресценции исторически были полезны в подтверждение личности родной гель комплексов, современных коррелированных по времени одиночных фотонов подсчета (TCSPC) может обеспечить гораздо больше информации. TCSPC позволяет не только характеристика комплексов на основе флуоресценции продолжительностей жизни, но также делает возможным подробное описание передачи энергии между спектральных составляющих в рамках комплекса. Такого рода характеристика становится все более необходимой, как использование различных систем спреды родной гель и обнаруживаются новые предполагаемые комплексы, позволяя выявление белковых комплексов лучше пройти проверку подлинности и предоставление новых биофизической информации о том, как работают эти комплексы.
В этой статье мы предоставляем метод, который позволяет тех, кто имеет мало или нет опыта с родной гель-электрофорез для достижения высокого качества резолюции родной тилакоидов комплексов для целей расследования механики легких реакций фотосинтез. Эта базовая техника затем могут быть расширены на усмотрение экспериментатора улучшить результаты или расширить применимость других видов. Мы затем описать процесс для подвергая родной гель зеленые полосы TCSPC, а также некоторые шаги для базового анализа и представления данных, предоставляемых методом. Муфта родной гель-электрофорез с TCSPC анализом расширяет полезность этих систем гель, предоставляя аутентификации и биофизические характеристики белковых комплексов в пределах полосы. Зеленый гель системы, описанные здесь основана на разработанной Аллен и Штелин17 с некоторыми изменениями и является таким же, как используется в Шварц и др. 20. Эта система является одним из многих, но имеет специфические особенности, которые являются полезными для этой методологии. Это достаточно быстро, так что тилакоидов изоляции, электрофорез геля и TCSPC анализ удобным может выполняться в один день, позволит устранить потенциальные проблемы хранения проб и деградации. Мы также считаем, что этот метод является надежной в руках неопытных пользователей, обеспечивая результаты этого диапазона от хорошего до начальника, в зависимости от степени оптимизации.
Важно иметь в виду, что зависит от комплексов, визуализируется на родной гель моющего средства и буферной системы, используемые, а также на биологию организма под следствием. Различных моющих средств и буферной системы преференциально отдельных видов различных комплексов, и данный фотосинтетических организмов будет иметь различные комплексы от других живых организмов, не все из которых будут присутствовать при любых обстоятельствах. Системы, описываемой здесь особенно подходит для изучения мегакомплексов PSI, как описано в Шварц и др. 20, но он падает на более дестабилизирующее конце спектра для тех, кто обучается PSII мегакомплексов. Для всестороннего изучения различных моющих средств и буфера систем, используемых в родной гель-электрофорез тилакоидных белков рекомендуется пересмотреть ярви и др. 21 и Рантала и др. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

Свет реакции фотосинтеза осуществляется серия пигментированной белковых комплексов в тилакоидной мембраны. Стехиометрии и организации этих комплексов высокодинамичные как длинные, так и шкал короткое время благодаря процессам, которые адаптируют фотосинтез к изменяющимся условиям окружающей среды (то есть, не фотохимического тушения, переходы между состояниями и Долгосрочный ответ). Исторически эти процессы были описаны спектроскопически с точки зрения изменений в хлорофилловое свечение, и спектроскопии остается жизненно важным методом для мониторинга фотосинтетической параметров. Существует ограниченное количество способов, в котором основной белок сложной динамики могут быть визуализированы. Здесь мы описываем быстрый и простой метод для разделения с высоким разрешением и визуализации тилакоидов комплексов, родной зеленый гель-электрофорез. Этот метод в сочетании с коррелированных по времени одиночных фотонов, считая подробных характеристик свойств флуоресценции хлорофилла полос, разделенных на зеленый гель.

Представитель результаты для зеленой электрофорез представлены на рисунке 1. Переулок 1 приведен пример идеальных результатов для электрофореза геля зеленым шпинатом тилакоидов, в котором видны максимальное количество четкие, резкие зеленые полосы. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Здесь мы представляем протокол для разделения тилакоидов растворимых комплексов электрофорезом геля родной зеленый. Основные шаги для анализа данных предоставляются и впоследствии зеленый гель полосы характеризуются по время коррелирует одного фотонов подсчета (TCSPC).

Разделение шпинат тилакоидов белковых комплексов родной электрофорез геля Грин и группа характеристик с помощью подсчета Time-Correlated один фотон

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Этот метод полезен для ответа на некоторые ключевые вопросы в области исследований фотосинтеза, такие как такие как такие осязаемые тилакоидные комплексы физиологически реальных комплексов с энергетически связанными компонентами? Основным преимуществом описанного здесь зеленого геля и протокола TCSPC является то, что он быстрый и надежный. Образцы могут быть легко обработаны и проанализированы в течение одного дня, что делает вопросы хранения и стабильности менее озабоченность.Хотя TCSPC может дать представление о фотосинтетических системах, которые мы изучали здесь, он также может быть применен к другим системам, начиная от химических и биологических, таких как исследования флуоресцентного молекулярного движения в жидкостях, клетках или новых структурных мотивах, таких как мономолекулярные слои и ионные жидкости. Для начала этой процедуры подготовьте необходимые фондовые решения и зеленые мини-гели, изложенные в текстовом протоколе. Далее, получить лед и тусклый свет.Используя стеклянный гомогенизатор Dounce, полностью гомогенизируйте листья шпината примерно в один-два миллилитров буфера ТМК. Чтобы создать простое фильтрующее устройство, разрежьте тонкую задачу разтрите пополам и сложите ее в четвертинки. Снимите поршень со шприца, а затем упаковать сложенную задачу протрите в нижней части шприца.Pipette лист гомогената в центре задачи протрите фильтр, а затем использовать поршень пройти гомогенат через фильтр и собрать его в 1,5-миллилитровую центрифугу трубки. Центрифуга гомогената при 5000 г и 4 градуса по Цельсию в течение 10 минут гранулировать нерастворимый материал, в том числе тилакоидные мембраны. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в один миллилитр буфера ТМК.Чтобы извлечь хлорофилл из каждого образца, возьмите 50-микролитр aliquot и передать его в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Добавьте 950 микролитров метанола, крышка трубки, и перемешать, инвертирование его несколько раз. Центрифуга при 10 000 г в течение 10 минут, чтобы гранулировать осажденные белки.Используя измерения концентрации хлорофилла в качестве руководства, удалите и выбросьте некоторый объем из каждого образца по мере необходимости, пока каждая трубка не содержит одинаковое общее количество хлорофилла. Центрифуга при 5 000 г в течение 10 минут, чтобы повторно гранулировать тилакоидные мембраны. Удалите и отбросьте супернатант, будьте осторожны, чтобы удалить все супернатанты, не нарушая гранулы.Во-первых, оттепель aliquot TMK 30%glycerol моющего средства решения. Переверните несколько раз, чтобы смешать и сохранить раствор на льду. Добавьте соответствующий объем раствора моющего средства, чтобы растворить гранулы и привести к окончательной концентрации хлорофилла один миллиграмм на миллилитр.Pipette вверх и вниз неоднократно, будучи осторожным, чтобы избежать вспенивания в образце. Затем держите образец на льду, чтобы тилакоид образцов solubilize. После завершения растворимой центрифугировать образец на 10 000 г и 4 градуса по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать нерастворимый материал, что приводит к ясному, темно-зеленому супернатанту.После этого загрузите 15 микролитров солубилизованного тилакоида супернатанта непосредственно на каждую колодец ранее подготовленного 1,5-миллиметрового родного геля. Используя 1X работает буфер, начать работать родной зеленый гель на 100 вольт. Поместите весь гель бак на мокрый лед на время бега, чтобы смягчить резистивное нагревание.Когда гель закончил работать, удалите его из клетки электрофорезиса и промойте бегущий буфер от гелеобразных пластин дистиллированной водой. Снимите верхнюю пластину с геля, а затем промойте гель дистиллированной водой. Поместите гель, который все еще находится на нижней стеклянной пластине, на лед; когда гель не используется, накройте его полиэтиленовой пленкой и держите его в темноте, чтобы предотвратить его высыхание.Далее, используйте острый скальпель или лезвие бритвы, чтобы акциз каждой полосы интересов, когда готовы приступить к анализу TCSPC. Убедитесь, что вырезанная полоса не содержит загрязняющих материалов полосы. Для каждого анализируемого комплекса используйте флуоресцентный спектрометр, чтобы сделать комнатно-температурный флуоресцентный спектр от 600 до 800 нанометров.Поместите маскировочную ленту на обоих концах слайдов и сложите ее в течение нескольких раз, чтобы создать спейсеры, что позволит слайды, которые будут проводиться вместе твердо, не сжимая пространство между ними, а затем бутерброд гель ломтик между двумя слайдами стеклянной микроскопии. Добавьте небольшое количество воды к ломтику геля на краю стеклянных слайдов, чтобы создать гладкий интерфейс, который уменьшит рассеяние сигнала. Далее, зажим гель бутерброд в луч путь так, что луч поражает гель ломтик через открытый край пластин.Для каждого комплекса соберите 10 000 точек данных через регулярные промежутки времени по всему спектру выбросов флуоресценции. Чтобы проанализировать данные для данного комплекса, сначала нормализуйте пиковую высоту каждой кривой распада для всех собранных длин волн, затем хвост соответствует каждой кривой распада к устойчивому спектру флуоресценции состояния комплекса, как указано в текстовом протоколе. Репрезентативные результаты для зеленого геля электрофорез является примером идеального результата для анализа шпината тилакоидов, где ряд четких, острых зеленых полос видны.Переулки 2 и 3 представляют более типичные результаты от простой изоляции тилакоида и электрофореза на недиардиенте 5%acrylamide гель. Переулки 4, 5 и 6 являются примером плохих результатов из-за повышения степени под solubilization образца thylakoid, в то время как полоса 7 демонстрирует результаты, которые могут быть достигнуты, когда Arabidopsis thylakoids используются вместо шпината. После того, как кривые данных TCSPC были установлены в тот же реестр времени, они могут быть нормализовыты до той же пиковой высоты, что позволяет сравнивать кривые в качестве первого анализа данных.Пиковые нормализованные кривые распада из различных комплексов могут быть наложены друг на друга на данной длине волны, что позволяет визуализировать различия в поведении между комплексами. Хвост, соответствующий кривым распада, позволяет создавать спектры, связанные с распадом. Как видно здесь, связанные с распадом спектры LHCII отличается отсутствием динамических особенностей, а форма спектра флуоресценции LHCII остается такой же, как и сигнал распадается с течением времени.Распад спектра флуоресценции также задерживается, требуя 100 пикосекунд для достижения максимальной флуоресценции. Это говорит о том, что энергия не передается между энергетически отчетливыми пигментами внутри комплекса по мере распада флуоресценции. Затем спектры, связанные с распадом, строятся для комплекса Band 5.По сравнению с LHCII, флуоресценция от Band 5 распадается гораздо быстрее, достигая максимальной интенсивности всего за 30 пикосекунд, а затем распадается до менее чем 20% от первоначальной интенсивности после 500 пикосекунд. При попытке этой процедуры важно помнить, что интерпретация данных TCSPC будет опираться на дополнительную биохимическую информацию, идентифицяющие компоненты изучаемых комплексов, например, 2 DSDS-PAGE и Western Blotting или масс-спектрометрию.

Research

JoVE Journal

Environment

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Оптимизированная Отрицательный Окрашивание: Высокая пропускная протокол за рассмотрение Малый и Asymmetric Protein Structure по электронной микроскопии

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Выбор размера Автоматизированная гель для улучшения качества секвенирования библиотек следующего поколения, полученного из окружающей среды проб воды

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Характеристика и применение пассивных пробоотборников для мониторинга пестицидов в воде

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Выделение и характеристика поверхностно-активных веществ от атмосферных аэрозолей

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Измерение и сопоставление моделей осаждения, относящиеся к концентрации карбоната почвы под управление сельским хозяйством и эрозии почвы

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Сбор и извлечения образцов профессиональных воздуха для анализа ДНК, грибковых

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Характеристика водных биоплёнки с проточной цитометрии

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Количественная оценка завод растворимого белка и усваиваемых углеводов контента, используя кукурузы (Zea mays) как образец

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Обнаружение тилапии озеро вирус с помощью обычных RT-PCR и SYBR зеленый RT-ПЦР

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...