Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
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Financiación y apoyo fueron proporcionados por el Departamento de química de la Universidad Estatal de Michigan.

1. soluciones preparación para verter el gel verde nativo
<ol><li>Preparar 4 x solución amortiguadora concentrada para resolver geles consisten en glicerol al 40%, glicina de 200 mM y 100 mM Tris amortiguada a pH 8.3.</li>
	<li>Preparar 4 x solución amortiguadora concentrada para apilar los geles consisten en glicerol al 40%, glicina de 200 mM y 100 mM Tris amortiguada a pH 6,3.</li>
	<li>Almacenar estos búferes a 4 ° C para evitar el crecimiento de moho. Nota: Los topes son estables durante meses a 4 ° C, por...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

Un éxito tilacoides solubilización y gel nativo ejecutar resultará en la resolución de múltiples bandas verdes visibles distintas sobre el gel sin la distorsión significativa o mancharse de las bandas. Sobrecargar el gel, una alta concentración de detergente, un pH de muestra incorrecta, disuelta material, correr el gel a temperatura demasiado elevada o demasiado rápidamente y un gel incorrectamente vertido son factores que pueden contribuir a complejos de tilacoides mal resuelto. Y optimizar las condiciones del ...

Organismos fotosintéticos constantemente deben ajustar su fisiología a las cambiantes condiciones ambientales para maximizar su productividad y competir con éxito con vecinos1. Esto es especialmente cierto de la maquinaria responsable de las reacciones de luz de la fotosíntesis, como luz ambiental condiciones pueden fluctuar por tres órdenes de magnitud entre las sombras y a plena luz del sol. Además, factores ambientales tales como sequía, frío o estrés por calor pueden reducir la disponibilidad de dióxido de carbono para la fijación de carbono, que es el fregadero del electrón natural para los productos de las reacciones de luz. Plantas deben, por lo tanto, cosechar y utilizar radiación solar tan eficientemente como sea posible sin perder la capacidad de disipar el exceso de energía luz según sea necesario. Mientras que photooxidative daño todavía ocurre rutinariamente bajo todas las condiciones de luz2,3, falta lograr excitación absorbe energía con éxito puede conducir al daño catastrófico celular y muerte. Varios mecanismos adaptativos existen que permiten que el aparato fotosintético a ajustarse a los cambios en las condiciones ambientales prevalecientes y a las fluctuaciones transitorias (es decir, en plazos cortos y largos)4. Estos incluyen la respuesta a largo plazo (LTR) y Temple no fotoquímica (NPQ). NPQ es en sí mismo considerado para abarcar por lo menos tres otros fenómenos de componente, incluyendo las transiciones de estado (qT), amortiguamiento de energía rápidamente inducible (qE) y fotoinhibición (qI)5.
Estos procesos fueron originalmente observados y define en gran medida en términos de fenómenos espectroscópicos [e.g., NPQ se refiere a una gota en observada fluorescencia (quenching de fluorescencia de la clorofila) que no es debido a un aumento en la tasa de fotoquímica]6. El término "las transiciones de estado" se refiere igualmente al cambio observado en la cantidad relativa de la fluorescencia de PSI y PSII7. Mientras que las técnicas espectroscópicas que han posibilitado la enumeración de estos fenómenos [en particular, la amplitud de pulso modulada de espectroscopia de fluorescencia (PAM)] y siguen siendo un medio vital para observar y diseccionar los procesos fotosintéticos en vivo, mucho de la bioquímica es necesaria para aclarar los mecanismos subyacentes a estas observaciones espectroscópicas. Transiciones de estado, por ejemplo, implica un ciclo de la fosforilación/desfosforilación de las proteínas LHCII por la STN7 cinasa y la fosfatasa TAP38/PPH1, respectivamente8,9,10. Este ciclo ajusta la distribución física de la antena LHCII entre los dos fotosistemas moviendo una porción de trimers LHCII de PSII a PSI, cambiando así la absorción de la sección transversal de los fotosistemas11,12. El componente FC de NPQ rápidamente convierte la energía de exceso de excitación en calor a través de las acciones del ciclo de epoxidación/de-epoxidación de violaxantina/zeaxantina y la proteína de subsidiarios. El papel exacto de subsidiarios en este proceso es aún no comprendido del todo13. El componente de qI de NPQ, fotoinhibición, generalmente se atribuye al daño a la proteína D1 del PSII. Restauración de competencia fotosintética total requiere un proceso de reparación elaborados para solucionar dañado PSII photocenters. El ciclo de reparación PSII implica la migración de complejos PSII de la pilas granal, desmantelamiento de los complejos, recambio de proteínas dañadas de la D1, rearmado de los complejos PSII y el movimiento de complejos PSII en el granal pilas14. La naturaleza exacta de la fotoinhibición y PSII fotodaño sigue siendo objeto de intenso escrutinio15.
La dificultad en el estudio de fenómenos como el estado de las transiciones o reparación PSII surge en parte del hecho de que hay no una forma simple de visualizar la mecánica de sistemas bioquímicos complejos. El enfoque clásico de la bioquímico para entender un proceso es primero separar sus componentes por lo que puede ser caracterizados en aislamiento. Electroforesis nativa surgieron de los esfuerzos exitosos en la década de 1980 para separar y caracterizar los complejos del fotosistema de los tilacoides con más métodos de preparación (es decir, centrifugación de gradiente de sacarosa y cromatografía)16. Los sistemas detergentes para solubilizar suavemente los conjuntos nativos de las membranas tilacoides pronto fueron adaptados a los métodos de separación electroforética, en particular por Allen y Staehelin17 y y Peter y Thornber18, dando lugar a electroforesis en gel verde nativo. Mientras que representan sólo uno de una variedad de técnicas en el arsenal experimental, página nativa tiene un número de características atractivas que han hecho un método ampliamente empleado en la investigación de la fotosíntesis. Página nativa es relativamente rápida y sencilla, requiriendo equipo poco especializado, ofreciendo al mismo tiempo la separación de alta resolución de un gran número de complejos de tilacoides. Esto hace que página nativa una herramienta conveniente para estudiar la dinámica de los tilacoides y, cuando se combina con la página estándar de la segunda dimensión, así como una variedad de sistemas de tampón y detergente, un versátil sistema para la búsqueda y caracterización de nuevos complejos de tilacoides.
Dicho esto, los geles verdes nativos han tenido una reputación de ser una técnica poco fiable, especialmente en manos inexpertas, ya que es fácil producir resultados pobres consisten en geles borrosos, graso con pocas bandas. Este problema fue solucionado, en parte, con la introducción del azul natural página19. El uso de tinte coommassie en el sistema BN hace separación de las proteínas más robusto. Por lo tanto, BN-página suele ser una técnica más fiable y más fácil para un novato relativa configurar y puede proporcionar separaciones de alta resolución de los complejos de tilacoides. Por estas razones, BN-PAGE se ha convertido en el método de elección para la mayoría de los trabajos de este campo. BN-PAGE es generalmente más lento correr de electroforesis en gel verde, su principal inconveniente es que la coloración de tinte de coommassie interfiere con la identificación de bandas débiles que contiene clorofila, además de hacer aguas abajo espectroscópicas Caracterización problemática.
La información bioquímica proporcionada por geles nativos y 2D SDS-PAGE puede fortalecerse enormemente cuando se combina con los datos de técnicas espectroscópicas. Independientemente del sistema empleado, un problema central con el uso de geles nativos para identificar complejos es que la identificación siempre puede ser impugnada (es decir, las proteínas se encuentran en una banda podría siempre representan complejos comigrating o componentes, sino de un solo complejo fisiológico auténtico). Caracterización espectroscópica proporciona información biofísica sobre los pigmentos en las bandas de gel verde y puede utilizarse para determinar qué tipo de complejos son capaces de contener. Fluorescencia de la clorofila es especialmente útil en este sentido debido a la a menudo dramáticamente diversos espectros y cursos de la vida de la fluorescencia que son característicos de complejos pigmento fotosintéticos diferentes proteínas. Mientras que los espectros de fluorescencia de estado estacionario simple 77K históricamente han sido útiles para confirmar las identidades de los complejos de gel nativo, moderno tiempo-correlacionada fotón contando (TCSPC) puede proporcionar mucha más información. TCSPC permite no sólo la caracterización de los complejos basados en cursos de la vida de la fluorescencia, pero también hace posible la descripción detallada de la transferencia de energía entre componentes espectrales dentro de un complejo. Este tipo de caracterización se está convirtiendo en cada vez más necesaria como el uso de varias extensiones de sistemas de gel nativo y se descubren nuevos supuestos complejos, permitiendo la identificación de complejos de la proteína para ser mejor autenticados y proporcionar nuevos información biofísica sobre el funcionamiento de estos complejos.
En este trabajo ofrecemos un método que permite a los que tienen poca o ninguna experiencia con electroforesis nativa para lograr alta calidad de resolución de los complejos de tilacoides nativo con el fin de investigar los mecanismos de las reacciones de luz de fotosíntesis. Esta técnica básica entonces se puede aumentar a criterio del experimentador para mejorar resultados o ampliar la aplicabilidad a otras especies. Luego Describimos el proceso para sujetar vendas de gel verde nativo TCSPC, así como algunos pasos para el análisis básico y presentación de los datos proporcionados por la técnica. El acoplamiento de electroforesis nativa con análisis TCSPC amplía la utilidad de estos sistemas de gel proporciona autenticación y caracterización biofísica de complejos de proteína dentro de las bandas. El sistema de gel verde descrito aquí se basa en que desarrollado por Allen y Staehelin17 con algunas modificaciones y es el mismo que el utilizado en Schwarz et al. 20. este sistema es uno de los muchos pero tiene características específicas que son útiles para esta metodología. Es lo suficientemente rápida para que aislamiento de tilacoides, electroforesis y análisis TCSPC conveniente se pueden realizar en un día, evitando posibles problemas de almacenamiento de la muestra y degradación. También encontramos que este método es robusto en las manos de usuarios inexpertos, sin dejar de ofrecer resultados que van de bueno a superior, dependiendo del grado de optimización.
Es importante tener en cuenta que los complejos visualizados en un gel nativo en el detergente y el buffer sistemas utilizados, así como sobre la biología del organismo bajo investigación. Diferentes sistemas de tampón y detergente preferentemente separan diferentes tipos de complejos, y un organismo fotosintético determinado tendrá diferentes complejos de otros organismos, no todos los cuales estarán presentes en cualquier circunstancia dada. El sistema descrito aquí es particularmente adecuado para el estudio de megacomplexes PSI, como se describe en Schwarz et al. 20, pero cae en el extremo más desestabilizador del espectro para quienes estudian megacomplexes PSII. Para un estudio exhaustivo de los diversos sistemas de tampón y detergente usados en electroforesis nativa de tilacoides proteínas, se recomienda revisar Järvi et al. 21 y Rantala et al. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

Las reacciones de luz de la fotosíntesis se llevan a cabo por una serie de complejos de proteína pigmentada en las membranas tilacoides. La estequiometría y la organización de estos complejos es altamente dinámica en el largo y corto plazos debido a los procesos que se adaptan la fotosíntesis a las cambiantes condiciones ambientales (es decir, el amortiguamiento no fotoquímica, las transiciones de estado y la respuesta a largo plazo). Históricamente, estos procesos se han descrito espectroscópico en términos de cambios en la fluorescencia de la clorofila y espectroscopia sigue siendo un método esencial para el monitoreo de parámetros de fotosíntesis. Hay un número limitado de formas en que se puede visualizar la compleja dinámica de la proteína subyacente. Aquí describimos un método rápido y simple para la separación de alta resolución y visualización de complejos de tilacoides, electroforesis en gel verde nativo. Este método se combina con tiempo-correlacionada fotón contando para la caracterización detallada de las propiedades de fluorescencia de clorofila de bandas separadas en el gel verde.

Resultados representativos para la electroforesis del gel verde se presentan en la figura 1. Carril 1 proporciona un ejemplo de resultados ideales para electroforesis en gel verde de espinaca tilacoides, en el que un número máximo de bandas verdes claro, agudos es accesibles. Estos resultados son un tanto atípicos, en parte porque no todas las bandas en el carril 1 normalmente están presentes en una muestra determinada. Limpieza adicional de la muestra, e...

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Aquí presentamos un protocolo para separar complejos de tilacoides solubilizado por electroforesis nativa en verde. Bandas de gel verde posteriormente se caracterizan por tiempo correlacionó solo fotón contando (TCSPC) y pasos básicos para el análisis de los datos se proporcionan.

Separación de espinacas tilacoides complejos de proteínas por electroforesis en Gel verde nativo y caracterización de banda utilizando conteo de fotones solo Time-Correlated

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Este método es útil para responder a ciertas preguntas clave en el campo de la investigación de fotosíntesis como son complejos tilakoid putativos fisiológicamente complejos reales con componentes energéticamente conectados? La principal ventaja del gel verde y el protocolo TCSPC descrito aquí es que es rápido y robusto. Las muestras se pueden procesar y analizar fácilmente en un solo día, lo que hace que los problemas de almacenamiento y estabilidad sean menos preocupantes.Aunque TCSPC puede proporcionar información sobre los sistemas fotosintéticos que hemos estudiado aquí, también se puede aplicar a otros sistemas que van desde productos químicos a través de productos físicos y biológicos, como estudios de movimiento molecular fluorescente en líquidos, células o motivos nuevos-estructurales como capas monomoleculares y líquidos iónicos. Para comenzar este procedimiento, prepare las soluciones de stock necesarias y mini geles verdes como se describe en el protocolo de texto. A continuación, obtenga un poco de hielo y atenúe las luces.Usando un homogeneizador Dounce de vidrio, homogeneizar completamente las hojas de espinaca en aproximadamente uno a dos mililitros de tampón TMK. Para crear un dispositivo de filtrado simple, corte una delicada limpieza de tareas por la mitad y dóblela en cuartos. Retire el émbolo de una jeringa y, a continuación, empaquete la toallita de tarea plegada en la parte inferior de la jeringa.Pipetear la hoja homogeneizar en el centro del filtro de limpieza de tareas, a continuación, utilice el émbolo para pasar el homogeneizar a través del filtro y recogerlo en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugar el homogeneización a 5.000 g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar el material insoluble, incluidas las membranas tilakoideas. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en un mililitro de tampón TMK.Para extraer la clorofila de cada muestra, tome una alícuota de 50 microlitros y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 950 microlitros de metanol, tapar el tubo, y mezclar invirándolo varias veces. Centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos para peletizar las proteínas precipitadas.Utilizando las mediciones de concentración de clorofila como guía, retire y deseche un poco de volumen de cada muestra según sea necesario hasta que cada tubo contenga la misma cantidad total de clorofila. Centrifugar a 5.000 g durante 10 minutos para re-pellet las membranas tilakoide. Retire y deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de quitar todo el sobrenadante sin alterar el pellet.En primer lugar, descongelar una alícuota de solución de detergente TMK 30%glicerol. Invertir varias veces para mezclar y mantener la solución en hielo. Añadir un volumen adecuado de la solución detergente para disolver el pellet y dar lugar a una concentración final de clorofila de un miligramo por mililitro.Pipetear hacia arriba y hacia abajo repetidamente mientras tiene cuidado de evitar la espuma en la muestra. Luego, mantenga la muestra sobre hielo para permitir que las muestras de tilakoide se solubilien. Una vez completada la solubilización, centrifuga la muestra a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos para peletizar el material insoluble, lo que resulta en un sobrenadante de color verde claro y oscuro.Después de esto, cargue 15 microlitros de sobrenadante de tilakoide solubilizado directamente en cada pozo de un gel nativo de 1,5 milímetros previamente preparado. Usando el búfer de funcionamiento 1X, comience a ejecutar el gel verde nativo a 100 voltios. Coloque todo el tanque de gel sobre hielo húmedo durante la carrera para mitigar el calentamiento resistivo.Cuando el gel haya terminado de funcionar, retírelo de la célula de electroforesis y enjuague el tampón de funcionamiento de las placas de gel con agua destilada. Retire la placa superior del gel y luego enjuague el gel con agua destilada. Coloque el gel, que todavía está en la placa de vidrio inferior, sobre hielo;cuando el gel no esté en uso, cúbralo con una envoltura de plástico y manténgalo en la oscuridad para evitar que se seque.A continuación, utilice un bisturí afilado o una cuchilla de afeitar para extirpar cada banda de interés cuando esté lista para continuar con el análisis de la TCSPC. Asegúrese de que la banda excómoda no contenga material de banda contaminante. Para cada complejo que se está analizando, utilice un espectrómetro fluorescente para crear un espectro fluorescente de temperatura ambiente entre 600 y 800 nanómetros.Coloque la cinta de enmascaramiento en cada extremo de las diapositivas y dóblela varias veces para crear espaciadores, lo que permitirá que las diapositivas se sostengan juntas firmemente sin comprimir el espacio entre, luego empareje la rebanada de gel entre dos diapositivas de microscopía de vidrio. Añade una pequeña cantidad de agua a la rebanada de gel en el borde de los portaobjetos de vidrio para crear una interfaz suave que reducirá la dispersión de la señal. A continuación, sujeta el sándwich de gel en la trayectoria de la viga para que la viga golpee la rebanada de gel a través del borde abierto de las placas.Para cada complejo, recopile 10.000 puntos de datos totales a intervalos regulares en todo el espectro de emisión de fluorescencia. Para analizar los datos de un complejo determinado, primero normalice la altura máxima de cada curva de decaimiento para todas las longitudes de onda recopiladas, luego la cola haga coincidir cada curva de decaimiento con el espectro de fluorescencia de estado estacionario del complejo como se describe en el protocolo de texto. Los resultados representativos de la electroforesis de gel verde proporcionan un ejemplo de un resultado ideal para el análisis de tilakoides de espinacas, donde una serie de bandas verdes claras y nítidas son visibles.Los carriles 2 y 3 presentan resultados más típicos del aislamiento simple de tilakoide y electroforesis en un gel de acrilamida 5% no gradiente. Los carriles 4, 5 y 6 proporcionan un ejemplo de malos resultados debido al aumento de los grados de bajo solubilización de la muestra de tilakoide, mientras que el carril 7 demuestra los resultados que se pueden lograr cuando se utilizan tilakoidos de Arabidopsis en lugar de espinacas. Una vez que las curvas de datos de los datos TCSPC se han establecido en el mismo registro de tiempo, se pueden normalizar a la misma altura máxima, lo que permite comparar las curvas como un primer análisis de los datos.Las curvas de decaimiento normalizadas por picos de diferentes complejos se pueden superponer entre sí en una longitud de onda determinada, lo que permite visualizar las diferencias de comportamiento entre los complejos. La cola que coincide con las curvas de descomposición permite la construcción de espectros asociados a la decadencia. Como se ve aquí, los espectros asociados a la descomposición para el LHCII son notables por la falta de características dinámicas y la forma del espectro de fluorescencia LHCII sigue siendo la misma que la señal decae con el tiempo.La descomposición del espectro de fluorescencia también se retrasa, requiriendo 100 picosegundos para alcanzar la fluorescencia máxima. Esto sugiere que la energía no se transfiere entre pigmentos energéticamente distintos dentro del complejo a medida que la fluorescencia se descompone. A continuación, se construyen los espectros asociados a la descomposición para el complejo Band 5.En comparación con el LHCII, la fluorescencia de la Banda 5 decae mucho más rápidamente, alcanzando la intensidad máxima en sólo 30 picosegundos y luego decayéndose a menos del 20% de la intensidad inicial después de 500 picosegundos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la interpretación de los datos de la TCSPC se basará en información bioquímica adicional que identifique los componentes de los complejos en estudio, por ejemplo, por 2 DSDS-PAGE y Western Blotting o espectrometría de masas.

Research

JoVE Journal

Environment

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Investigación

Medio ambiente

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