Name: separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Finansiering och stöd tillhandahölls av Institutionen för kemi vid Michigan State University.

1. stamlösningar förberedelse för hälla infödda grön geler
<ol><li>Förbereda en 4 x buffertlösning med koncentrerad för att lösa geler som består av 40% glycerol, 200 mM glycin och 100 mM Tris buffrad till pH 8,3.</li>
	<li>Förbereda en 4 x koncentrerad buffertlösning för stapling geler som består av 40% glycerol, 200 mM glycin och 100 mM Tris buffrad till pH 6,3.</li>
	<li>Lagra dessa buffertar vid 4 ° C att förhindra tillväxt av mögel. Obs: Buffertar är stabila i månader vid 4 ° C, så beredn...

<ol>
	<li>Yamori, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+response+to+fluctuating+environments+and+photoprotective+strategies+under+abiotic+stress.">Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress.</a> Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).</li><li>Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+II+reaction+center+damage+and+repair+in+Dunaliella+salina+(Green+Alga)+(analysis+under+physiological+and+irradiance-stress+conditions).">Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions).</a> Plant Physiology. 103 (1), 181-189 (1993).</li><li>Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+the+photosystem+II+D1+protein+in+higher+plants+under+photoinhibitory+and+nonphotoinhibitory+irradiance.">Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (34), 25476-25482 (1993).</li><li>Dietze, l. L., Br&#228;utigam, K., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+acclimation:+state+transitions+and+adjustment+of+photosystem+stoichiometry-functional+relationships+between+short-term+and+longterm+light+quality+acclimation+in+plants.">Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants.</a> FEBS Journal. 275 (6), 1080-1088 (2008).</li><li>Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+light+harvesting+in+green+plants.">Regulation of light harvesting in green plants.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).</li><li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+fluorescence:+a+probe+of+photosynthesis+in+vivo.">Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).</li><li>Williams, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+interaction+of+the+two+photosystems+in+photosynthesis.">Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis.</a> Nature. 225 (5239), 1214-1217 (1970).</li><li>Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions+and+light+adaptation+require+chloroplast+thylakoid+protein+kinase+STN7.">State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.</a> Nature. 433 (7028), 892-895 (2005).</li><li>Shapiguzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PPH1+phosphatase+is+specifically+involved+in+LHCII+dephosphorylation+and+state+transitions+in+Arabidopsis.">The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (10), 4782-4787 (2010).</li><li>Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+plastid+protein+phosphatase+TAP38+in+LHCII+dephosphorylation+and+thylakoid+electron+flow.">Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow.</a> Public Library of Science Biology. 8 (1), (2010).</li><li>Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+lateral+distribution+of+the+light-harvesting+chlorophyll-a/b-protein+complex+induced+by+its+phosphorylation.">Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation.</a> European Journal of Biochemistry. 136 (1), 25-29 (1983).</li><li>Minagawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+transitions--the+molecular+remodeling+of+photosynthetic+supercomplexes+that+controls+energy+flow+in+the+chloroplast.">State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (8), 897-905 (2011).</li><li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotochemical+Chlorophyll+Fluorescence+Quenching:+Mechanism+and+Effectiveness+in+Protecting+Plants+from+Photodamage.">Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage.</a> Plant Physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).</li><li>Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+assembly+of+thylakoid+protein+complexes:+multiple+assembly+steps+of+photosystem+II.">Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II.</a> Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 159-168 (2005).</li><li>Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Photodamage+and+Protein+Turnover+in+Photoinhibition.">Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition.</a> Trends in Plant Science. , (2018).</li><li>Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+photosystem+I+complexes+from+octyl+glucoside/sodium+dodecyl+sulfate+solubilized+spinach+thylakoids:+characterization+and+reconstitution+into+liposomes.">Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes.</a> Plant Physiology. 78 (3), 606-613 (1985).</li><li>Allen, K. D., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+16+to+20+chlorophyllprotein+complexes+using+a+low+ionic+strength+native+green+gel+system.">Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system.</a> Analytical Biochemistry. 194 (1), 214-222 (1991).</li><li>Peter, G. F., Thornber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+composition+and+organization+of+higher+plant+photosystem+II+light-harvesting+pigment-proteins.">Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (25), 16745-16754 (1991).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosystem+I-LHCII+megacomplexes+respond+to+high+light+and+aging+in+plants.">Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants.</a> Photosynthesis Research. 136 (1), 107-124 (2018).</li><li>Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439 (2), 207-214 (2011).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92 (5), 951-962 (2017).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).</li></ol>

En framgångsrik tylakoida lösbarhet och infödda gel kör kommer att resultera i resolutionen av flera distinkta synliga gröna band på gel utan betydande snedvridning eller smetar av banden. Överbelastning av gel, en hög tvättmedel koncentration, en Felaktiga prov pH, oupplösta material, Kör gelen alltför snabbt eller vid för hög temperatur, och ett felaktigt hällde gel är alla faktorer som kan bidra till dåligt löst tylakoida komplex. Samtidigt optimera villkoren i gelen själv (t.ex., akrylamid...

Fotosyntetiska organismer måste hela tiden anpassa sin fysiologi till förändrade miljöförhållanden att maximera sin produktivitet och framgångsrikt konkurrera med grannar1. Detta gäller särskilt maskinens ansvarar för ljus reaktionerna fotosyntes, som omgivande ljus villkor kan fluktuera med tre tiopotenser mellan skuggor och fullt solljus. Miljöfaktorer såsom torka, kyla eller värmestress kan dessutom minska tillgängligheten av koldioxid för kol fixering, som är naturliga elektron diskbänken för produkter av ljus reaktionerna. Växter måste, därför skörda och utnyttja solstrålning så effektivt som möjligt samtidigt behålla möjligheten att skingra överskott ljus energi som behövs. Medan photooxidative skador fortfarande uppstår rutinmässigt under alla ljusförhållanden2,3, misslyckande att hantera absorberas exciteringsenergi framgångsrikt kan leda till katastrofala cellskador och döden. Flera adaptiva mekanismer finns som tillåter fotosyntetiska apparaten stämmas både förändringar i rådande miljöförhållanden och övergående fluktuationer (dvs. över både långa och korta tidsskalor)4. Dessa inkluderar långsiktiga svar (LTR) och icke-fotokemiska kylning (NPQ). NPQ är i sig anses omfatta minst tre andra komponent fenomen, inklusive tillståndsövergångar (qT), släcka snabbt inducerbara energi (qE) och photoinhibition (qI)5.
Dessa processer var ursprungligen observerade och definieras i hög grad genom spektroskopiska fenomen [t.ex. NPQ refererar till en droppe i observerade klorofyll fluorescens (kylning av klorofyll fluorescens) som inte beror på en ökning av andelen Fotokemi]6. Termen ”state transitions” på samma sätt avser observerade ändringen i det relativa beloppet av fluorescens från PSI och PSII7. Medan de spektroskopiska tekniker som har möjliggjort en uppräkning av dessa fenomen [i synnerhet pulsamplitud modulerade (PAM) fluorescens-spektroskopi] och fortsätta att vara ett viktigt medel för observation och dissekera fotosyntetiska processer i vivo, en hel del av biokemi som krävs för att klarlägga mekanismerna bakom dessa spektroskopiska observationer. Statliga övergångar, innebär exempelvis en fosforylering/Defosforylering cykel av LHCII proteiner av STN7 kinase och TAP38/PPH1 fosfatas, respektive8,9,10. Denna cykel justerar fysiska distributionen av LHCII antennen mellan de två fotosystem genom att flytta en del av LHCII trimerer från PSII PSI, därmed förändra absorptionen tvärsnitt av fotosystem11,12. Komponenten qE i NPQ omvandlar snabbt överflödig excitation energi till värme genom violaxanthin/zeaxantin epoxidering/de-epoxidering cykeln och proteinet PsbS agerande. PsbS exakta roll i denna process är fortfarande inte helt klarlagt13. Komponenten qI i NPQ, photoinhibition, är allmänt tillskrivs skada till D1 proteinet av PSII. Restaurering av full fotosyntetiska kompetens kräver en genomarbetad reparationsprocessen fixar skadade PSII photocenters. PSII reparera cykeln innebär migration av PSII komplex ur den granal stackar, demonteringen av komplexen, byte av skadade D1 proteiner, ihopsättning av PSII komplexen och förflyttning av PSII komplex tillbaka till den granal stackar14. Den exakta innebörden av photoinhibition och PSII åldrad hud är fortfarande föremål för intensiv granskning15.
Svårigheten att studera fenomen som stat övergångar eller PSII reparation uppstår delvis från det faktum att det finns inte ett enkelt sätt att visualisera komplexa biokemiska system mekanik. Den klassiska biochemical tillvägagångssätt att förstå en process är att först skilja dess komponenter så att de kan karakteriseras i isolering. Infödda gelelektrofores uppstod från framgångsrika insatser på 1980-talet att separera och karakterisera de fotosystem komplex från tylakoida membran med fler förberedande metoder (nämligen sackaros gradient centrifugering och kromatografi)16. De tvättmedel system utvecklat för att försiktigt solubilize de infödda komplex från tylakoida membranen anpassades snart till elektroforetisk separationsmetoder, framför allt genom Allen och Staehelin17 och och Peter och Thornber18, ger upphov att infödda grön gelelektrofores. Samtidigt som företräder enda ur en mängd olika tekniker i den experimentella arsenalen, infödda sida har ett antal attraktiva egenskaper som har gjort det en allmänt sysselsatta metod i fotosyntesen forskning. Infödda sida är relativt snabb och enkel, kräver lite specialutrustning, samtidigt som den ger hög upplösning separation av ett stort antal tylakoida komplex samtidigt. Detta gör infödda sida ett praktiskt verktyg för att studera tylakoida dynamics och, när de kombineras med STANDARDSIDA i den andra dimensionen samt en mängd tvättmedel och buffert-system, ett mångsidigt system för att hitta och karakterisera nya tylakoida komplex.
Som sagt, har infödda grön geler haft ett rykte om att vara en opålitlig teknik, särskilt i oerfarna händer, eftersom det är lätt att producera dåliga resultat bestående av fuzzy, smetig geler med några band. Problemet var löst, delvis, med införandet av blå-native sida19. Coommassie färgämnet i BN buffert systemet gör protein separation mer robust. Därför, BN-sida är ofta en enklare och mer tillförlitlig teknik för en relativ nybörjare att ställa in och kan ge hög upplösning separationer av tylakoida komplex. Av dessa skäl blivit BN-sida vald analysmetod för de flesta arbete i det här fältet. Medan BN-sidan är i allmänhet långsammare att köra än gröna gelelektrofores, dess huvudsakliga nackdelen är att den coommassie färgämnet färgning stör identifiering av svag klorofyll-innehållande band, samtidigt också göra nedströms spektroskopiska karakterisering problematiska.
Den biokemiska informationen tillhandahålls av infödda geler och 2D SDS-PAGE kan stärkas kraftigt när de kombineras med data från spektroskopiska tekniker. Oavsett systemets sysselsatt, centrala problem med att använda inhemska geler för att identifiera komplex är att identifieringen alltid kan ifrågasättas (dvs. proteinerna som finns i ett band kunde alltid representerar comigrating komplex eller komponenter, snarare än en enstaka fysiologiskt autentiska komplex). Spektroskopiska karakterisering ger biofysiska information om pigmenten i grön gel band och kan användas för att bestämma vilka typer av komplex de sannolikt kommer att innehålla. Klorofyll fluorescensen är särskilt användbart i detta sammanhang på grund av de ofta dramatiskt olika spektra och fluorescens livstider som är karakteristiska för olika fotosyntetiserande pigment-proteinkomplex. Medan enkla steady state 77K fluorescens spectra har historiskt sett varit användbar för att bekräfta identiteter för infödda gel komplex, kan moderna tid-korrelerade single photon counting (TCSPC) ge mycket mer information. TCSPC tillåter inte bara karakterisering av komplex baserat på fluorescens livstider, men också möjliggör en detaljerad beskrivning av energiöverföring mellan spektrala komponenter i ett komplex. Denna typ av karakterisering allt viktigare som användning av olika inhemska gel system sprider och ny förmodad komplex upptäcks, möjliggör identifiering av proteinkomplex autentiseras bättre och tillhandahålla nya biofysiska information om hur dessa komplex fungerar.
I detta dokument ger vi en metod som gör det möjligt för dem som har liten eller ingen erfarenhet med infödda gelelektrofores att uppnå hög kvalitet upplösning av infödda tylakoida komplex i syfte att undersöka mekaniken i ljus reaktioner fotosyntesen. Denna grundläggande teknik kan sedan utökas de experimenter's eget gottfinnande att förbättra resultat eller utvidga tillämpligheten till andra arter. Sedan beskriver vi processen för att utsätta infödda grön gel band för TCSPC, samt några steg för grundläggande analys och presentation av data som tillhandahålls av tekniken. Kopplingen av infödda gelelektrofores med TCSPC analys sträcker sig nyttan av dessa gel system genom att tillhandahålla autentisering och biofysiska karakterisering av proteinkomplex inom banden. Grön gel systemet beskrivs här baseras på som utvecklats av Allen och Staehelin17 med vissa modifieringar och är samma som används i Schwarz et al. 20. detta system är en av många men har specifika funktioner som är användbara för denna metod. Det är snabb nog så att tylakoida isolering, gelelektrofores och TCSPC analys bekvämt kan utföras på en dag, undanröja potentiella problem för förvaringen och nedbrytning. Vi tycker också att denna metod är robust i händerna på oerfarna användare, samtidigt som det ger resultat som sträcker sig från bra till överlägsen, beroende på graden av optimering.
Det är viktigt att komma ihåg att de komplex som visualiseras på en native gel beror på både tvättmedel och buffert-system som används, samt på biologin av organismen under utredning. Olika rengöringsmedel och buffert system separera företrädesvis olika typer av komplex, och en given fotosyntetiska organismer har olika komplex från andra organismer, inte alla som kommer att närvara under en viss omständighet. Systemet beskrivs här är särskilt lämpad för studiet av PSI megacomplexes, som beskrivs i Schwarz et al. 20, men det faller på den mer destabiliserande änden av spektrumet för de som studerar PSII megacomplexes. För en omfattande studie av de olika tvättmedel och buffert system som används i inhemska gelelektrofores av tylakoida proteiner, är det rekommenderat att granska Järvi et al. 21 och Rantala o.a. 22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decyl Maltoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7658</td>
			<td>n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td>37.5/1 C 40% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spinach thylakoid protein complexes by native green gel electrophoresis and band characterization using time-correlated single photon counting

Ljus reaktionerna fotosyntes utförs av en serie pigmenterade proteinkomplex i tylakoida membran. Det stökiometri och organisationen av dessa komplex är högdynamiska på både långa och korta tidsskalor på grund av processer som anpassa fotosyntesen till förändrade miljöförhållanden (dvs. icke-fotokemiska snabbkylning, tillståndsövergångar, och den långsiktiga svar). Historiskt har dessa processer har beskrivits spectroscopically när det gäller förändringar i klorofyll fluorescens och spektroskopi förblir en viktig metod för att övervaka fotosyntetiska parametrar. Det finns ett begränsat antal sätt där den underliggande protein complex dynamiken kan visualiseras. Här beskriver vi en snabb och enkel metod för högupplösta separation och visualisering av tylakoida komplex, inbyggda grön gelelektrofores. Denna metod är tillsammans med tid-korrelerade enda fotonen räkna för detaljerad karakterisering av klorofyll fluorescens egenskaper band separeras på grön gel.

Representativa resultat för gröna gelelektrofores presenteras i figur 1. Lane 1 innehåller ett exempel på perfekt resultat för grön gelelektrofores av spenat thylakoids, där ett maximalt antal tydliga, skarpa gröna band är synliga. Dessa resultat är något atypiska, delvis eftersom inte alla de band som uppträder hos lane 1 finns normalt i ett givet prov. Ytterligare prov rensning, i form av kloroplast isolering innan tylakoida lösbarhet och gradi...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting a

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

Här presenterar vi ett protokoll för att separera solubilized tylakoida komplex med infödda grön gelelektrofores. Grön gel band kännetecknas därefter av tid korrelerade Single Photon Counting (TCSPC) och grundläggande steg för dataanalys finns.

Separation av spenat tylakoida proteinkomplex av infödda grön gelelektrofores och bandet karakterisering med Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Denna metod är användbar för att besvara vissa viktiga frågor inom området fotosyntes forskning såsom är förmodade thylakoid komplex fysiologiskt verkliga komplex med energiskt anslutna komponenter? Den största fördelen med den gröna gel och TCSPC-protokollet som beskrivs här är att det är snabbt och robust. Prover kan lätt bearbetas och analyseras på en enda dag, vilket gör frågor om lagring och stabilitet mindre av ett problem.Även TCSPC kan ge insikt i de fotosyntetiska system som vi har studerat här, kan det också tillämpas på andra system som sträcker sig från kemiska genom fysiska och biologiska såsom studier av fluorescerande molekylär rörelse i vätskor, celler eller nya strukturella motiv såsom monomolekylära lager och joniska vätskor. Till att börja detta förfarande, förbereda de beskad lager lösningar och gröna mini geler som beskrivs i textprotokollet. Därefter får du lite is och dämpar belysningen.Med hjälp av en dounce-homogenisator av glas homogeniserar du helt spenatbladen i ungefär en till två milliliter TMK-buffert. För att skapa en enkel filtreringsanordning, skär en känslig uppgift torka på mitten och vik den i fjärdedelar. Ta bort kolven från en spruta, och packa sedan den vikta uppgiften torka i botten av sprutan.Pipettera blad homogenatet i mitten av task-torka filter, sedan använda kolven för att passera homogenate genom filtret och samla den i en 1,5-milliliter centrifuge rör. Centrifugera homogenatet vid 5, 000 g och fyra grader Celsius i 10 minuter för att pelleta det olösliga materialet, inklusive thylakoidmembranen. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i en milliliter av TMK-buffert.För att extrahera klorofyll från varje prov, ta en 50-microliter alikvot och överföra den till en 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Tillsätt 950 mikroliter av metanol, locket röret, och blanda genom att invertera det flera gånger. Centrifugera vid 10, 000 g i 10 minuter för att pelleta de utfällda proteinerna.Med klorofyllkoncentrationsmätningarna som vägledning avlägsnar och kasserar du viss volym från varje prov efter behov tills varje rör innehåller samma totala mängd klorofyll. Centrifug vid 5, 000 g i 10 minuter för att åter pelleta thylakoidmembranen. Ta bort och kasta supernatanten, var noga med att ta bort all supernatant utan att störa pelleten.Först tina en alikvot av TMK 30%glycerol tvättmedel lösning. Invertera flera gånger för att blanda och hålla lösningen på is. Tillsätt en lämplig volym av tvättmedelslösningen för att lösa upp pelleten och resultera i en slutlig klorofyllkoncentration på ett milligram per milliliter.Pipetten upp och ner upprepade gånger samtidigt som den är noga med att undvika skumning i provet. Sedan, hålla provet på is så att thylakoid prover att solubilisera. Efter solubilisering är klar, centrifug provet vid 10, 000 g och fyra grader Celsius i 10 minuter att pelleten det olösliga materialet, vilket resulterar i en klar, mörkgrön supernatant.Efter detta, ladda 15 mikroliter av solubilized thylakoid supernatant direkt på varje brunn av en tidigare beredd 1,5-millimeters native gel. Använda 1X kör buffert, börja köra den infödda gröna gelen på 100 volt. Placera hela geltanken på våt is under hela körningen för att mildra resistiv uppvärmning.När gelen har kört färdigt, ta bort den från elektroforescellen och skölj bort rinningsbufferten av gelplattorna med destillerat vatten. Ta bort den översta plattan från gelén och skölj sedan gelen med destillerat vatten. Placera gelen, som fortfarande är på botten glasskivan, på is;när gelén inte används, täck den med plastfolie och hålla den i mörker för att förhindra att den torkar ut.Därefter använder en skarp skalpell eller rakblad för att punktskatt varje band av intresse när redo att gå vidare med TCSPC analys. Se till att det strukna bandet inte innehåller något förorenande bandmaterial. För varje komplex som analyseras, använd en fluorescerande spektrometer för att göra ett rumstemperatur fluorescerande spektrum mellan 600 och 800 nanometer.Placera maskeringstejp på vardera änden av bilderna och vik den över flera gånger för att skapa distanser, vilket gör att bilderna hålls samman ordentligt utan att komprimera utrymmet mellan, sedan smörgås gelskivan mellan två glasmikroskopi diabilder. Tillsätt en liten mängd vatten till gel slice vid kanten av glaset diabilder för att skapa en smidig gränssnitt som kommer att minska signalspridning. Därefter kläm fast gelsmörgåsen i strålbanan så att strålen slår i gelskivan genom plattornas öppna kant.För varje komplex samla in 10, 000 totala datapunkter med jämna mellanrum över fluorescensemissionsspektrumet. För att analysera data för ett visst komplex, först normalisera topphöjden för varje sönderfallskurva för alla de våglängder som samlas in, sedan svans matcha varje förfall kurva till steady state fluorescens spektrum av komplexa som beskrivs i textprotokollet. Representativa resultat för den gröna gelelektroforesen ger ett exempel på ett idealiskt resultat för analys av spenatolakoider, där ett antal tydliga, skarpa gröna band syns.Körfält 2 och 3 presentera mer typiska resultat från enkla thylakoid isolering och elektrofores på en icke-gradient 5%akrylamid gel. Körfält 4, 5 och 6 ger ett exempel på dåliga resultat på grund av ökande grader av under solubilization av thylakoid provet, medan lane 7 visar de resultat som kan uppnås när Arabidopsis tylakoider används i stället för spenat. Efter att datakurvorna för TCSPC-data har ställts in på samma tidsregister kan de normaliseras till samma topphöjd, vilket gör att kurvorna kan jämföras som en första analys av data.Topp-normaliserade förfall kurvor från olika komplex kan sedan överlagras med varandra vid en viss våglängd, vilket gör att skillnaderna i beteende mellan komplexen att visualiseras. Svans som matchar sönderfallskurvorna möjliggör konstruktion av förfallsrelaterade spektra. Som ses här, den förfall-associerade spektra för LHCII är anmärkningsvärt för bristen på dynamiska funktioner och formen på LHCII fluorescens spektrum förblir densamma som signalen sönderfaller över tiden.Sönderfallet av fluorescensspekten är också försenat, vilket kräver 100 picoseconds för att nå maximal fluorescens. Detta tyder på att energi inte överförs mellan energiskt distinkta pigment inom komplexet som fluorescens sönderfaller. Den förfallsrelaterade spektra konstrueras sedan för Band 5-komplexet.Jämfört med LHCII, fluorescensen från Band 5 sönderfaller mycket snabbare, når maximal intensitet i endast 30 picoseconds och sedan sönderfaller till mindre än 20% av den ursprungliga intensiteten efter 500 picoseconds. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att tolkningen av TCSPC data kommer att förlita sig på ytterligare biokemisk information som identifierar komponenterna i de komplex som studeras, till exempel av 2 DSDS-PAGE och Västra Blotting eller masspektrometri.

Research

JoVE Journal

Environment

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimerad Negativ Färgning: a hög kapacitet protokoll för prövningen Liten och Asymmetric Protein Structure genom elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Automatiserad Gel Storlek Val för att förbättra kvaliteten på nästa generations sekvensering bibliotek Framställd från Miljö vattenprov

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Karakterisering och tillämpning av passiva provtagare för övervakning av bekämpningsmedel i vatten

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Extraction and Characterization of Surfactants from Atmospheric Aerosols

Extraktion och karakterisering av Surfactants från atmosfär Aerosoler

Surface-active compounds, or surfactants, present in atmospheric aerosols are expected to play important roles in the formation of liquid water clouds in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Mätning och kartläggning mönster jorderosion och nedfall kopplad till jord karbonat koncentrationer Under jordbrukets förvaltning

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Samling och utvinning av yrkesmässig luftprover för analys av svamp DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Karakterisering av vattenlevande biofilmer med flödescytometri

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Kvantifiera växt lösligt Protein och lättsmält kolhydrat innehåll, med hjälp av majs (Zea mays) som ett föredöme

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Upptäckt av Tilapia sjön Virus använder konventionella RT-PCR och SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...